淺談蛋白質含量的測定
淺談蛋白質含量的測定
張 琳,顧風云,秦宇婷,姜卓君,劉傳玉
(吉林省產品質量監督檢驗院,吉林長春 130000)
摘 要:蛋白質是人體中非常重要的組成成分。蛋白質含量測定的常用方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法及燃燒法等?;诖?,本文對蛋白質含量的測定進行了研究。
關鍵詞:蛋白質;分析方法;凱氏定氮法
蛋白質是構成生命的重要物質[1]。在人體的細胞和組織中,蛋白質是非常重要的組成成分。在人體中,蛋白質占了人體質量的18%,其與生命現象有著密切的關系。人體內蛋白質的種類很多,但性質和功能各有區別。因此,蛋白質的檢測方法就顯得尤為重要。凱氏定氮法是測定蛋白質含量最為普遍的方法,同時相比較于其他檢測方式,其具有更多優勢[2],如易于操作、實驗過程安全、成本較為合理、測定結果準確。因此,凱氏定氮法成為食品檢驗工作中普遍的測定方法。
1 實驗儀器與試劑
實驗儀器:電子天平(Metteler Toledo ML204);石墨消解儀(濟南海能儀器股份有限公司);全自動凱氏定氮儀(山東海能科學儀器有限公司)。
試劑:硫酸銅;硫酸鉀;硫酸;硼酸;氫氧化鈉;甲基紅指示劑;溴甲酚綠指示劑;95%乙醇溶液。
2 實驗方法
2.1 實驗原理
食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解,產生的氨和硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后以硫酸或者鹽酸標準滴定溶液滴定,根據酸的消耗量計算氮含量。凱氏定氮法的反應過程包含以下幾個方面。
消化:蛋白質+濃硫酸硫酸銨+二氧化碳+二氧化硫+水
蒸餾:氫氧化鈉+硫酸銨→氨氣+硫酸鈉+水
吸收:氨氣+硼酸→硼酸銨+水
滴定:硼酸銨+水+鹽酸→氯化銨+硼酸
2.2 滴定注意事項
在滴定過程中需要注意以下兩點。①指示劑為甲基紅溴甲酚綠,其在堿性條件下變藍,酸性條件下暗變紅。②催化定氮片。硫酸銅催化劑;硫酸鉀防止暴沸。
2.3 樣品處理及實驗步驟分析
①稱量。固體試樣0.2~2 g、半固體試樣2~5 g,液體試樣10~25 g。②消化。于消化管中加入硫酸銅、硫酸鉀,10 mL濃硫酸后,放置石墨消解爐上消解90 min,消解溫度為420 ℃,消解儀可選用曲線加熱模式和直線加熱模式。③上機。消解后的樣品冷卻后,可上機測試。上機測試前,需要對機器進行清洗,包括接受杯、堿管路,機器,清洗完畢后,先測試空白樣品,再測試樣品。④計算。根據公式可知,試樣的質量、試劑空白滴定液體積、試樣滴定液體積和氮換算為蛋白質的系數是變量,因此,實驗過程中需要關注天平的準確性、消解是否完全、機器清洗是否干凈、空白試劑的滴定體積數以及試驗滴定液體積數是否準確。
3 儀器常規維護保養
①儀器要有良好的通風和散熱條件。②儀器測試時首先進入清洗界面選擇,換酸清洗3次左右,當改變滴定酸的濃度時,用換酸清洗的方法將管路及滴定器中的滴定酸排凈,再用新換酸沖洗至少6次,并及時排液。③測樣前連續做儀器空白測試[3]。等到儀器穩定后可測試樣品(將機器中的堿量調為零,進行測試,當滴定體積之差小于0.05 mL,機器即為穩定)。④每日實驗結束后,清洗接收杯1~2次以及堿管路2次,用洗瓶沖洗蒸餾頭殘余堿液。儀器前部的槽皿中,如果積有液體,將其擦洗干凈。⑤為了延長防濺裝置的使用壽命,請每天工作結束后清洗,即消化管內加入一半左右的蒸餾水(以蒸餾完成消化管液體不溢出為準),上機蒸餾,一般清洗2次左右(空蒸儀器把加堿量設置為“0”)。⑥儀器使用結束后要關閉水源、電源,儀器上要安裝空消化管(防止防濺裝置內殘留液體流到儀器上)。⑦為防止堿路結晶影響儀器壽命,在完成實驗后,進行堿管路清洗。若儀器長時間不用或者使用時間一周以上時,應將堿桶中的堿液換為蒸餾水;將消化管放好,選擇手動加堿,達到清洗管路的作用,防結晶堵塞。⑧堿液桶、硼酸液桶應定期清理沉淀物并清洗干凈。⑨儀器長期使用,在蒸餾瓶中會有水垢產生,將影響加熱效率(建議6個月清理1次);如使用頻繁,可增加清洗頻率[4]。通過加蒸餾水管路加入除垢劑或一定濃度的弱酸性溶液清洗干凈,按蒸餾水排水閥排凈,再用蒸餾水多次沖洗后將管路連接好。⑩如儀器存放環境溫度低于零度以下應排空儀器內所有液體,以免造成儀器損壞。
4 注意事項
①實驗前,試劑要準備充足,保證滿足本批次實驗;②開機前要打開冷卻循環水,保證冷卻效果;③強酸強堿反應劇烈,建議設置加10~20 mL蒸餾水進行稀釋;④添加氫氧化鉀溶液的體積數為濃硫酸體積的4倍,最為適宜;⑤開始進行蒸餾時,消化管中液體的總體積以不超過總體積的1/3為宜;⑥拿取消化管的過程中需要注意高溫燙傷。在放置消化管時,需要左右旋轉幾下,確保消化管與蒸餾頭密封;⑦禁止使用邊緣有缺口,或者有裂縫的消化管;⑧儀器蒸餾過程中如遇緊急情況,可直接關閉電源開關;⑨排廢液管的出口要比儀器安放位置低,以使排液暢通。
5 實際應用與現狀
在目前檢測中,食品中蛋白質含量測試參照《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》(GB 5009.5—2016)、《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》(GB/T 6432—2018),同時,凱氏定氮儀還可以測定食品中揮發性鹽基氮的含量,參照標準為GB 5009.228—2016以及測定大豆肽粉中多肽含量,參照標準為GB/T 22492—2008。凱氏定氮法測量蛋白質含量最為合適[5]。蛋白質的測定有凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法和燃燒法,其具體操作及特點如下。
5.1 凱氏定氮法
準備4個50 mL凱氏燒瓶并標號,向1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品,另外兩個燒瓶作為對照,在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物,再加入濃硫酸,將4個燒瓶放到消化架上進行消化,之后進行蒸餾,全部蒸餾完畢后用標準鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量,直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色,即為滴定終點,結算出蛋白質含量。
5.2 雙縮脲法
雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法,硫銨不干擾顯色,Cu2+與蛋白質的肽鍵以及酪氨酸殘基絡合,形成紫藍色絡合物,此絡合物在540 nm波長處有最大吸收。首先利用標準蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標準曲線,將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合[6],并用只加入硫酸鈉不含血清的試管作為對照,將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑,充分混合后于37 ℃環境中放置10 min,在540 nm波長處進行比色,以對照管調零,讀取吸光度值,由標準曲線上直接查出蛋白質含量。雙縮脲法常用于0.5~10 g/L含量的蛋白質溶液測定。
5.3 酚試劑法
取6支試管分別標號,前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液,最后一支試管加待測蛋白質溶液,不加標準蛋白溶液,每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致,將液體混合均勻,在室溫下放置30 min,以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照,于650 nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。
5.4 紫外吸收法
大多數蛋白質在280 nm波長處有特征的最大吸收,這是由于蛋白質中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用于測定0.1~0.5 mg/mL含量的蛋白質溶液。取9支試管分別標號,前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液,1號試管不加標準蛋白溶液,最后一支試管加待測蛋白質溶液[7],而不加標準蛋白溶液,每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致,將液體混合均勻[8],在280 nm波長處進行比色,記錄吸光度值。
5.5 燃燒法
試樣在900~1 200 ℃高溫下燃燒,燃燒過程中產生混合氣體,其中碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收,氮氧化物被全部還原成氮氣,形成的氮氣氣流通過熱導檢測器進行檢測。此方法易操作[9],但需要購買氮/蛋白質分析儀,采購費用比較昂貴。
參考文獻
[1]張美娜.分光光度法在食品添加劑測定中的應用[J].糧食科技與經濟,2018,43(9):54-56.
[2]曹坎濤.蛋白質測定方法改進[J].河北化工,2011,34(10):26-27.
[3]莫佳琳,張思原,陸海勤,等.鉬酸銨分光光度法檢測糖廠工業磷酸含量的應用研究[J].甘蔗糖業,2015(1):52-56.
[4]吳賀標,張順紅.分光光度法檢測的應用及分析[J].啤酒科技,2001(10):51.
[5]李官慧.紫外-可見分光光度法在食品檢測及食品安全分析中的應用[J].中國標準化,2017(22):72-73.
[6]李婷.分光光度法在食品檢測中的應用標準研究[J].中國標準化,2017(16):57-58.
[7]郝麗紅.分光光度法在食品檢測中的應用標準研究[J].飲食科學,2017(14):12.
[8]湯亞芳.分光光度法在食品添加劑測定中的應用[J].廣東化工,2016,43(10):209.
[9]董宇芳,潘臨平.PAN萃取食品中錳的分光光度法的方法探討[J].山西食品工業,1998(2):39-40.

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