副溶血弧菌檢測方法的研究進展

　　

　　賈 晨1，王 丹2、王 琪3、劉 磊1，曲連海1，周 琦1

　　

　?。?.北京美正生物科技有限公司，北京 101100;2.龍大食品集團有限公司，山東萊西 266600;

　　

　　3.鄭州市食品藥品檢驗所，河南鄭州 450000）

　　

　　摘 要∶ 木文介紹了副溶血弧菌的傳統檢測方法、免疫學檢測方法和分子生物學檢測方法等幾種快速的檢測方法，通過對多種檢測方法的優缺點進行分析，為食品行業中副溶血弧菌的檢測方法選擇方面提供理論依據。

　　

　　關鍵詞∶ 副溶血弧菌;培養法;免疫學檢測;分子生物學檢測

　　

　　副溶血弧菌（岡切V。parahaemolyticus, EP）是一種革蘭氏 陰性嗜鹽性弧菌叫 常在河口、海底沉積物等海洋環境中， 以及魚貝類等海產品中檢出較多[2]»副溶血弧菌不僅嚴重危 害海水養殖業，還能引發人類胃腸炎、食物中毒等，是一種 條件致病菌口。近年來，由于誤食受副溶血弧菌污染或加工 不當的海產品而導致的食物中毒事件層出不窮，在我國部分 沿海地區，細菌性食物中毒位居首位折叫通過對副溶血弧 菌的快速檢測，可以有效防止相關疾病的傳播和發生。近年 來，對副溶血弧菌檢測方法的研究取得了較大的進展，本文 主要通過對多種檢測方法的優缺點進行分析，為檢測方法的 選擇提供理論基礎。

　　

　　1培養法

　　

　　目前，傳統的培養方法是國家標準對于副溶血弧菌的檢 測回，根據檢測需求，分為定性檢測和定量檢測。取樣品 25 g置于3%氯化鈉堿性蛋白蹤水（APW）中，分別進行定 性的增菌和定量的梯度稀釋后，接種到TCBS或弧菌顯色培 養基中。挑取可疑菌落，進行生理生化鑒定，如氧化酶試驗、 革蘭氏染色鏡檢、三糖鐵試驗、嗜鹽性試驗、生化鑒定、血 清學試驗、神奈川試驗等，整體操作時間過長，涉及到的試 驗方法以及試劑過多，易造成檢測結果出錯。

　　

　　1.1顯色培養基

　　

　　顯色培養基是近些年逐步應用在檢測行業的傳統培養基 代替品，它是一類由目標微生物的代謝產物中的酶，與特 異性的酶顯色底物進行反應，顯色酶底物與微生物代謝酶 相結合，顯色基團游離進而顯色的原理，檢測目標微生物 的新型培養基。與傳統的培養基相比，顯色培養基具有較 高的靈敏度和特異性。OLIVIA等使用弧菌的顯色培養基 和傳統培養基對于河口不同季節的水樣進行測定，通過對 菌株的測序，驗證了傳統培養基對創傷弧菌的假陽性率有 2%,霍亂弧菌的假陽性率為19%,而副溶血弧菌的假陽性 率達到59%?；【娘@色可以顯著降低假陽性率2?5倍。 EDDABRA等回對96個糞便和拭子樣本進行測試，通過顯 色培養基和TCBS（硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養 基）對比發現，霍亂弧菌在顯色培養基的檢出率為34%,在 TCBS中的檢出率為31%。對霍亂弧菌和副溶血弧菌的特異 性進行檢測，顯色培養基的特異性達到100%,而TCBS的 特異性只有93.33%。顯色培養基的特異性明顯高于TCBSo 1.2微生物測試片

　　

　　微生物測試片是預制型的培養基，釆用快速擴散技術、 新一代微生物顯色等創新技術，可實現菌落的快速增殖和判 讀，提高實驗室的檢測效率。許如蘇等?以副溶血弧菌、 霍亂弧菌、溶藻弧菌等49株標準菌對測試片的敏感性、特 異性和可重復性進行檢測。結果表明，副溶血弧菌在測試片 上表現為紫色菌落，其他非目標微生物顯示藍色或者不生 長；重復性試驗結果相對偏差偏低，檢測結果良好。但是由 于需要考慮實際樣本中的副溶血弧菌的檢測以及樣品的適 應性等多種因素干擾，有較高的難度。

　　

　　2免疫學檢測方法

　　

　　免疫學檢測方法主要有酶聯免疫法吸附法、血清型法、 免疫熒光技術、免疫擴散技術、免疫膠體金技術和免疫印跡 技術等[10]o它們主要的原理是應用抗原和抗體的特異性進 行檢測。但是免疫學檢測方法對于抗體的特異性要求較高， 同時最低檢出限偏高，導致漏檢的可能性。

　　

　　2.1免疫膠體金技術

　　

　　免疫膠體金技術是釆用抗原抗體相結合的原理，以膠體 金作為標志物的一種免疫標記技術。朱慧等凹制備了兔抗 副溶血弧菌多克隆抗體，并對其效價進行測定，提取副溶 血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌破碎蛋白， 確定4種標記蛋白的濃度，以及抗原蛋白的特異性檢測。檢 測結果表明膠體金試紙條準確鑒定出副溶血弧菌，排除其他 非目標菌的交叉反應干擾，對人工感染的結果可以進行準確 判斷。

　　

　　2.2酶聯免疫吸附法

　　

　　酶聯免疫吸附法簡稱ELISA,是酶聯免疫中應用較廣的 免疫測定技術。其原理是抗原或抗體固定在載體表面，在載 體表面發生抗原抗體反應，酶與底物發生顯色反應，洗滌后, 可通過吸光值進行檢測。ELISA方法可以進行定性或者定 量的分析。李國等凹從瀕死的文蛤中分離鑒定出一株副溶 血弧菌，并用該菌苗制備兔抗血清，以HRP-羊抗兔IgG為 酶標二抗，對人工感染副溶血弧菌的樣本進行ELISA檢測。 結果顯示，釆用間接ELISA技術檢測副溶血弧菌，人工污 染的文蛤樣本副溶血弧菌的檢出率為80%,健康文蛤樣本 的副溶血弧菌檢出率為15%。結果表明ELISA檢測法可以 用于發病文蛤的檢測，但還是有假陰性存在。

　　

　　3分子生物學檢測方法

　　

　　3.1 PCR方法

　　

　　隨著分子生物學的飛速發展，PCR的方法已經被逐漸的 寫入標準中。PCR 方法(Polymerase chain reaction, PCR), 又稱聚合酶鏈式反應，是一種通過溫度控制可實現體外擴增 特異DNA片段的技術。PCR檢測具有靈敏度高、特異性強 等優勢。KIM等1131基于toxR基因的PCR方法檢測副溶血 弧菌，釆用28個目標和非目標菌株建立了 PCR檢測方法， 通過494株菌株檢測目標菌株的特異性。結果75.5%的副 溶血弧菌較強的特異性，非目標菌株沒有得到擴增。PCR 檢測方法雖然靈敏度較高，但是過于依賴目標基因的分離和 富集，且易受到程序設置的干擾。

　　

　　3.2實時熒光定量PCR技術

　　

　　實時熒光定量PCR技術具有靈敏度高、重復性好、準 確性高等優點。王建昌等凹根據已知的副溶血弧菌基因組 序列，篩選特異性靶基因，設計特異性引物探針，優化反 應體系，并在體系內加入內參(必C),通過標記不同熒光 基團的Ihgman探針來監測IAC,進而實時監控整個PCR反 應。建立gyrB-IAC相關標準曲線，Ct值與拷貝數有良好的 線性關系；人工污染的初始菌量為7cfb/25g,樣品增菌6 h 后，副溶血弧菌即可檢出。胡興娟等凹針對副溶血性弧菌 侃基因，沙門菌。沖c基因和單增李斯特菌基因設計引 物和&gMan探針，建立3種致病菌的多重熒光定量PCR 檢測體系，并對海產品中的副溶血性弧菌、沙門菌和單增李 斯特菌的進行檢測。結果3種目標致病菌均可得到特異性擴 增，而其他非目標細菌均未見特異性擴增曲線。該體系對副 溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的最低檢測限均小于 100 cfu/mLo并對150粉實際樣本進行檢測，與國家標準法 檢出率一致。

　　

　　3.3環介導等溫擴增技術

　　

　　環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一種新型的核酸擴增方法，其特 點是在鏈置換特異的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的 作用下，設計4種特異引物，進行60 - 65 °C恒溫擴增， 15?60 min即可實現核酸擴增，具有操作簡單、特異性強 等特點。反應過程中加入染料等，在DNA合成時，從脫氧 核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出產生大量焦磷酸鎂沉 淀，呈現白色。因此，只需肉眼觀察產物中的濁度即可，操 作過程簡單，結果易判讀。胡元慶等兩用基因作為副溶 血弧菌的靶向基因，設計了 4條引物，優化LAMP檢測方 法中的反應體系和反應條件。體系用BstDNA聚合酶催化， 恒溫反應60 min,產物分別用2%瓊脂糖凝膠電泳和SYBR Green I染色鑒定，對各項反應參數進行優化；將菌液的10 倍稀釋液進行LAMP和PCR反應，并對32株食源性病原 菌進行LAMP擴增，驗證其特異性；結果顯示，確定25gL 體系中 Mg2+ 濃度為 3.6 mmol/L, dNTPs 濃度為 0.96 mmol/L, 聚合酶用量為4.8 U,內外引物濃度比為8 ： 1,最佳反應 溫度為63 P,時間為60 min； LAMP的最低檢測限明顯低 于PCR檢出限；對32個菌株進行特異性檢測，陽性率為 100%,說明LAMP具有較高的特異性。

　　

　　3.4重組酶聚合酶等溫擴增技術

　　

　　重組酶聚合酶等溫擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification, RPA),是可以替代傳統PCR的核酸檢測技 術，是新一代的等溫擴增核酸檢測技術。RPA技術基于重 組酶聚合酶，且最佳反應溫度在20 - 37 °C, 20 mm內完 成擴增反應。劉小青等"釆用RPA技術，建立了以，•滅 為靶基因的RPA-exo副溶血弧菌的引物探針，對引物探針 進行組合篩選，建立RPA-exo熒光探針快速檢測方法， 15 min可完成檢測,具有高特異性，無交叉反應，靈敏度較高 人工污染樣品加入終濃度為1.36x103 CFU/mL時，無需增菌 即可被檢出；實際樣品檢測檢測結果與GB 4789.7-2013結 果一致。

　　

　　4結語

　　

　　副溶血弧菌的檢測方法各有優缺點。傳統國家標準檢測 方法要經過培養基的基礎培養，挑取可疑菌落分離、增菌、 鏡檢和生化鑒定等煩瑣步驟；顯色培養基和微生物測試片使 用方便，但需要具有特異性較高的酶底物。免疫學檢測方法 對于抗體的特異性要求較高，同時最低檢出限偏高，導致漏 檢的可能性。分子生物學檢測方法具有靈敏度高、重復性好、 反應髙效、準確性高等優勢，但是過于依賴目標基因的分離 和富集，且容易受到程序設置的干擾。

　　

　　食品中副溶血弧菌檢測方法有傳統檢測方法、實時熒光 定量PCR、LAMP、RPA和MPCR-DHPLC法等，并可以 多種結合進行目標菌株鑒定。多種檢測方法相結合，融合 多種優勢，如LAMP技術與生物傳感器技術相結合，酶聯 免疫磁珠技術與PCR技術相結合，MALDI-TOF MS與16S rRNA鑒定相結合?；蛐酒夹g融合了 PCR、納米芯片和 探針雜交。

　　

　　上述針對副溶血弧菌的相關檢測方法，無論是從科學調 査角度還是食品安全角度來說，對副溶血弧菌的有效檢測都 存在著重要的研究意義。這些方法存在著一些不可忽視的問 題，應當綜合考慮各檢測方法優劣勢，在多項技術的基礎上 建立可以滿足多方面需求的快速、高效、經濟的檢測方法， 才能實現副溶血弧菌的有效檢測，保障食品安全。

　　

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