PCR 檢測技術在食品微生物檢測中的應用

　　

　　洪 亮

　　

　?。ㄉ虾５轮Z產品檢測有限公司，上海 200436）

　　

　　作者簡介：洪亮（1990—）,男，江蘇靖江人，本科，助理工程師。研究方向：食品安全。

　　

　　摘 要:PCR作為分子生物學的基礎技術，已經在環境工程、食品工程、醫藥行業等眾多領域得到了較為廣泛的應用。目前，多項食品安全國家標準中在生物鑒定環節也已引入PCR檢測方法。中華人民，共和國出入境檢驗檢疫行業標準、中華人民，共和國農業行業標準等多項標準引用該方法。本文就傳統微生物檢測方法存在的問題引出對各項 PCR 檢測技術在食品微生物檢測中的應用現狀進行列舉分析，提出各檢測方面的實際用途以及優缺點，以期為未來的 PCR 檢測技術發展提供方向。

　　

　　關鍵詞∶聚合酶鏈式反應;食品;檢測

　　

　　1傳統微生物檢測方法存在的問題

　　

　　每年夏季都是食源性疾病高發期，金黃色葡萄球菌、志 賀氏菌、大腸埃希氏菌和副溶血性弧菌等都是食品中較為常 見的致病菌，易引發人畜疾病，應進行嚴格質檢，確保食 品安全。目前，食品微生物檢測的國家通用標準主要為GB 4789系列，共計40多個標準方法，大部分標準方法都是釆 用培養法進行檢測分析。少數標準方法，例如GB 4789.6中 致瀉大腸埃希氏菌檢驗、GB 4789.42中諾如病毒檢驗等釆 用了聚合酶鏈反應（PCR）法。傳統檢測方法（培養法）的一般 流程為樣品稱量、增菌（預培養）、分離純化、生理生化鑒定、 菌株血清分型等，菌落形態觀察、菌株生化鑒定及血清學分 型等冗繁的操作歷時較長，對培養基和培養條件要求也較嚴 苛，易導致漏檢，且無法滿足部分廠商要求的快速檢測周期, 不利于及時發現問題、解決問題。此外，部分檢測用試劑毒 性較大，對檢測人員身體健康也容易造成威脅。同時，對于 新冠病毒等不便于培養的微生物來說，傳統的檢測方法也無 從解決檢測需求。

　　

　　近年來，隨著分子生物學檢測技術的快速發展，微生物 檢測的方法也日趨多元化、現代化。流式細胞儀、PCR儀 （Real-time PCR, RT-PCR等）、酶聯免疫吸附法和免疫層 析測定等多種較新的檢測方法或儀器的加入叫也使得食品 微生物檢測的靈敏度、特異性和檢測速度得到了極大的提升, 這些更為快捷、準確的檢測技術也更能適應人們對食品產品 質量的要求。

　　

　　2 PCR檢測技術在食品微生物檢測中的應用現狀

　　

　　PCR又稱聚合酶鏈式反應，是通過儀器和試劑在體外模 擬天然DNA復制的過程，可在較短時間內獲得大量目的基 因片段，再通過瓊脂糖凝膠電泳和熒光檢測技術等對目的片 段進行分析確認，最終可實現對食源性微生物進行準確的定 性分析。目前PCR作為分子生物學基礎技術，目前已經在 環境工程、食品工程、醫藥行業等多領域得到了較為廣泛的 應用四，特別是新冠疫情爆發之后，基于PCR技術的分子 生物學檢測技術得到了更為廣泛的應用，尤其是在醫藥領域 及鮮活農產品及食品領域的應用較之前更為頻繁。

　　

　　PCR檢測技術在食品微生物檢測中的應用與其在其他 領域的應用類似，需要特異性的引物與靶序列進行結合引 導反應的開始，整個反應包括DNA模板的變性解鏈、復性 （或稱退火）模板與引物結合、子鏈延伸等過程的不斷循環， 實現DNA的指數級增長，最終在短時間內獲得更多的目的 DNA片段，用于后續的凝膠電泳和基因測序等分析，以確 定擴增DNA的具體序列信息。PCR檢測技術非常適用于對 生長條件要求特殊，不容易實現常規增菌培養的微生物的檢 測、鑒定和分型。較常釆用的有常規PCR技術、實時熒光 定量PCR技術、RT-PCR檢測技術以及基于PCR的基因芯 片檢測技術等4種團。

　　

　　目前在食品領域這4種檢測技術不僅可用于微生物檢 測，還能應用在疫病檢測、食品種質資源鑒定、食物中轉基 因成分檢測、食物中過敏源成分檢測、藥食同源樣品基源鑒 定和產品真偽鑒別等方面。

　　

　　2.1常規PCR技術在食品微生物檢測中的應用

　　

　　常規PCR技術在食品微生物檢測中的應用一般用于同 時檢測多種食源性微生物以及對分離純化后的微生物進行 菌種鑒定等領域。前者主要通過在反應體系中同時加入多種 致病微生物的特異性引物以實現多個目的基因片段同時擴 增，共同分析，縮短檢測周期、縮減檢測費用的目標。后者 主要用于提高傳統檢測方法的準確率，防止漏檢、錯檢，也 適用于對未知菌株進行鑒定分型，為食品生產實踐過程中準 確分析污染源和制定針對性的除菌措施提供指導方向[4]o但 是常規PCR技術雖然造價較便宜，應用最為廣泛，但是也 只能單純的用作基因擴增，后續的基因分析還需要借助電泳 技術、熒光檢測技術或測序技術才能達到最終的檢測目標。 而且在后續染色環節還會用到漠化乙錠，易對檢測人員的身 體健康造成威脅。

　　

　　2.2實時熒光定量PCR技術在食品微生物檢測中的應用

　　

　　實時熒光定量PCR技術，是在常規PCR的基礎上，在 反應體系中加入熒光信號再利用儀器對信號進行監測，從而實現對起始模板進行定量和定性分析的方法。利用該技術對 食品微生物進行分析，可以避免在檢測過程中的交叉污染， 也省去了后續漠化乙錠等有毒物質染色及紫外熒光檢測等 步驟，自動化程度更高，特異性更強。當前，食品中多種致 病菌檢測以及霉菌、酵母、乳酸菌等定性及定量檢測都可釆 用該方法叫 雖然設備成本相對較高，但是節省人力，且更 為精準，目前應用較為廣泛'物。

　　

　　2.3基于PCR的基因芯片檢測技術

　　

　　基因芯片是目前較先進的一種高通量核酸分子雜交技 術，它通過原位合成或顯微打印技術將核酸分子探針按照擬 定的順序固定到固相介質芯片的表面，在將樣品的核酸分子 提取經PCR擴增后與該具有高密度的寡核昔酸陣列的芯片 上的探針進行雜交，最后再借助熒光掃描等技術對雜交信號 進行檢測，以確定樣品中特定微生物的存在情況回。

　　

　　大部分食品營養較為豐富，同時具備碳源、氮源、生長 因子等微生物生長需要的成分，適合多種微生物的生長繁 殖，因此很多食品樣品中微生物的種類較為繁雜、品種分布 隨機性強，而傳統的增菌、培養、純化鑒定等方法可能會導 致部分低豐度以及不容易培養的微生物漏檢，常規PCR多 限于檢測幾種微生物的基因，無法全面分析食品受污染的具 體狀況，對于生產者改良工藝提升產品質量指導意義不強。 而基因芯片具備的高通量、高度自動化等優點，可以為食品 微生物種類研究、致病菌毒力研究、藥敏基因檢測等提供有 力的數據支持頃山。此方法準確度高、可操作性強，但是 成本相對較高，目前在食品微生物檢測中應用尚不廣泛回。 但是隨著分子生物學技術的不斷發展和完善，基因芯片的制 作成本日益下降，相信在不久的將來，應該也會得到大范圍 的應用。

　　

　　2.4 RT-PCR檢測技術在食品微生物檢測中的應用

　　

　　RT-PCR即逆轉錄PCR,是通過將RNA逆轉錄為 cDNA,再通過常規的聚合酶鏈式擴增反應(PCR)實現在體 外快速擴增cDNA的過程。該技術多用于檢測食品中RNA 病毒污染，例如新冠病毒等檢測。疫情期間，三文魚、櫻桃 等檢測出新冠病毒，多釆用該法進行。但是該法使用范圍較 窄，一般僅用于以RNA為遺傳物質的病毒的檢測中，其他 微生物檢測不適用于該法。

　　

　　3結語

　　

　　由微生物(致病細菌、生物毒素、病毒等)造成的食源性 危害嚴重時可危及生命，檢測技術的進步使得人們能夠及時 發現，預防其對人類健康造成嚴重危害。目前基于PCR技 術的食品微生物檢測應用已經非常廣泛，商業化程度較高， 它一方面可以用于檢測食品中的致病菌存在情況，從而有效 防止食源性風險發生，另一方面也可以對食品中的菌相進行 分析，對于食品發酵和食品工藝改進等方面也有重大意義■ 此外，在水生動物疫病檢測、畜禽疫病檢測、農作物種質資 源鑒定、食品中轉基因成分檢測、食品中過敏源檢測、物種 鑒定、中藥材及食品真偽鑒別等方面，PCR作為基礎技術 也被廣泛應用?？傊?，無論是植物源食品還是動物源食品， 只要是涉及基因檢測，就一定會使用到PCR技術，PCR已 經成為檢測技術中最為常見的基礎技術手段皿。

　　

　　目前，雖然PCR技術應用廣泛，但是基于PCR的食品 微生物檢測技術對于復雜樣品仍然存在背景干擾和假陽性 等諸多問題，為了更好地防范由有害微生物污染帶來的食品 安全風險，進一步探索針對不同樣品合適的PCR反應體系 和反應條件，摸索開發出更靈敏、快捷、準確、通用的檢測 技術條件也迫在眉睫。此外，圍繞PCR進行的很多化學試 劑、酶、儀器等成本相對還是較高，隨著分子生物學技術的 發展和機械工業不斷發展，試劑耗材儀器成本的降低，相信 PCR技術的使用前景將更為廣闊。

　　

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