用于牛肉摻雜肉成分檢測的熒光PCR方法研究

2021-06-30 16:06:23 來源: 食品安全導刊

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  用于牛肉摻雜肉成分檢測的熒光PCR方法研究
  
  本文采用熒光PCR法對牛肉摻雜肉成分進行檢驗,以不同比例混合的牛肉、豬肉與鴨肉為樣品,分別采集樣品DNA,根據不同源性設定特異性引物和探針。根據實驗結果可知,該方法可有效檢測出同等質量下三種肉質的DNA濃度差異、質量百分比,且誤差不超過5%,通過該檢測方式的應用,可對牛肉中摻雜肉成分進行準確有效檢測。
  
  材料與方法
  
  試劑與設備 本實驗主要試劑為動物基因DNA提取試劑盒、Tap DNA聚合酶、分析純、引物和探針合成、人工全基因合成、無水乙醇。儀器為熒光PCR儀、高速冷凍離心機、絞肉機、電泳系統、恒溫混勻儀、電子天平。
  
  實驗方法
  
 ?。?)樣本制備。本實驗采用牛肉、豬肉和鴨肉,按照不同比例制備樣品;
  
 ?。?)DNA提取。選擇50g動物肌肉樣本,用絞肉機攪碎后,先將樣本選取特定量放入2ml離心管內,將3.8μL蛋白酶K溶液放入混均儀中,溫度設定66℃,時間為60min,間隔15min取出顛倒混勻后取出;提煉樣本中的上清液,將其提煉出后沉淀晾干,加入49μL超純水使其完全溶解,放入-18℃冰箱內存儲備用。
  
 ?。?)熒光PCR檢測。PCR反應體系為35μL,循環參數設置為95℃,變性4min,再運行35個循環,每個循環94℃,變性30s;將各樣本熒光PCR檢測設定為平行樣本,擴增Ct值選出兩個樣品的Ct值取均值;引物和探針階段,為檢測樣本內牛肉、豬肉的質量百分比,以牛源性、豬源性、鴨源性基因為靶基因,設置特異性引物與探針[1]。
  
  實驗結果
  
  特異 為檢驗該實驗中設計引物的特異性,以豬、鴨、牛的DNA為模板,利用引物和探針擴增樣本。根據實驗結果可知,牛源性基因特異性引物和探針與其他物種的DNA沒有反應,僅與牛DNA產生擴散曲線;豬源性基因特異性與其他DNA無反應,僅與豬DNA產生擴散曲線;鴨源性基因特異性與其他DNA無反應,僅與鴨DNA產生擴散曲線。由此可見,該實驗中引物與探針擁有良好的特異性。
  
  不同樣品DNA濃度差異 采用PCR技術進行樣本檢測,對多種動物源性質量比值進行分析,得出相同質量下豬肉、鴨肉與牛肉中DNA濃度差值。選取0.02g的牛肉、鴨肉與豬肉、0.04g的牛肉、鴨肉和豬肉進行測試,并采用以下公式對不同肉樣品質量與樣品DNA質量比值進行計算。
  
  式中,d為不同樣品質量與DNA質量比值。根據實驗結果可知,在質量為0.02g情況下,牛d為926.5,豬d為158,鴨d為42.7。在質量為0.04g情況下,牛d為925.7,豬d為583.5,鴨d為185.6。在質量存在差異時,d值可能因操作與儀器等原因產生一定誤差,取兩次實驗均值,即牛d為932.42,豬d為156.24,鴨d為11.53。
  
  質量百分比 采用熒光PCR檢測五個樣本中不同動物源性成分質量比值含量,分別從樣本中選取0.04g樣品進行PCR檢測,獲得質量百分比結果如下。樣品一:牛肉質量0.36,豬肉0.004,實際檢測質量比值為87.9%與12.1%;樣品二:牛肉質量0.028,鴨肉0.012,實際檢測質量比值為68.2%與31.8%;樣品三:牛肉質量0.026,豬肉0.014,實際檢測質量比值為63.5%與36.5%;可見,采用PCR檢測法可準確測出全部樣本中摻入的豬肉與鴨肉,且比值誤差不超過5%,與摻雜肉成分檢測需求相符合。
  
  綜上所述,本實驗采用熒光PCR技術對牛肉中摻雜肉成分進行檢測。根據實驗結果可有效判斷不同源性成分的質量比含量、DNA濃度差異等,有效改善市面上假肉情況,取得理想的牛源性成分檢測成果。
  
  參考文獻:
  
  [1]董洋洋.實時熒光PCR對牛肉中摻入鴨肉和豬肉的定量檢測研究[D].黑龍江八一農墾大學,2019.
  
  湛寶萍
  
  新疆昌吉州瑪納斯縣動物疾病預防控制中心
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