淺談食品微生物檢驗中菌落總數 和大腸菌群測定注意事項
摘要：當今，食品安全問題已經成為關系廣大人民群眾健康利益的重大問題，我國食品安全問題形勢嚴峻，引起了國家的高度重視，其中食品微生物污染問題歷年來居于食品不合格問題的前列。本文就食品微生物學檢驗中常檢項目菌落總數和大腸菌群測定應注意的事項進行分析與探討，希望對同行有所借鑒。
關鍵詞： 食品微生物檢驗；菌落總數；大腸菌群；注意事項
隨著社會的發展，人們對食物質量要求也越來越高，“吃得好”已經成為大家的普遍需求，而食品質量安全又是“吃得好”的前提。然而，食品企業在生產加工過程如果未能嚴格按照要求控制衛生條件，或者包裝容器清洗消毒不到位，亦或儲運過程不當，極易引起產品的微生物指標超標，從而使食用者健康受到危害。
當前，在我國食品安全監督抽檢中微生物檢驗項目主要有菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母、致病菌4類。菌落總數反映食品被細菌污染的程度；大腸菌群反映食品是否有被糞便污染；霉菌和酵母可使食品腐敗變質，并產生真菌毒素危害人體健康；致病菌可能引起食物中毒。其中，菌落總數和大腸菌群項目為科學評價食品衛生質量的重要指標，是絕大部分食品的必檢項目。在2019年上半年市場監管總局公布的不合格食品中，菌落總數超標和大腸菌群超標占微生物超標總數比例分別為60.78%和11.76%[[[] 王 嘉. 2019年上半年市場監管總局共公布不合格食品256批次，這七大類問題企業要關注 [N]. 中國質量報, 2019-06-28(6).]]。因此，為保障人民群眾的健康安全，必須提高菌落總數和大腸菌群檢測的準確性。筆者結合工作實際，就食品中菌落總數和大腸菌群測定應注意的事項進行闡述，希望對同行有所借鑒。
檢驗方法選擇
選擇正確的檢驗方法是檢驗結果準確可靠的前提。目前，食品中菌落總數測定的方法主要是GB 4789.2-2016，但是生活飲用水菌落總數測定方法卻為GB/T 5750.12-2006。這兩個標準最大的不同在于選用的培養基，GB 4789.2-2016 中為平板計數瓊脂（PCA），而GB/T 5750.12-2006 中為營養瓊脂（NA）。兩者的區別在于平板計數瓊脂更利于細菌的恢復和生長，同時又能防止細菌生長連成片狀[2] 楊慶文, 國譯丹, 周惠新, 等. 不同濃度 TTC 平板計數瓊脂細菌生長試驗觀察[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2012, 22(1): 62-63，如果采用GB 4789.2-2016測定水中菌落總數，可能導致測定結果偏高而使產品誤判。
對于大腸菌群檢測，現行的國家標準為GB 4789.3-2016，該標準包含兩種方法：MPN法和平板法。MPN法是一種半定量計數方法，適用于大腸菌群含量較低的食品的檢測；平板法為定量計數法，適用于大腸菌群含量較高的食品的檢測。正確使用這兩種方法的關鍵在于區分產品執行標準中限度的單位：當限度要求以“CFU/ g 或 CFU/mL”為單位時，我們應選擇平板法；當以“MPN/g 或 MPN/mL”為單位的，我們應選擇MPN法。然而一些特殊的產品，如醬油、醋和一些保健食品，限度要求以“MPN/100mL或MPN /100g”為單位，這時我們應選擇GB/T 4789.3-2003進行檢測，因為衛 生 部2009年 第 16 號公告明 確 規定：現行食品標準中規定的大腸菌群指標以“MPN/100克或MPN/100毫升”為單位的，適用《食品衛生微生物學檢驗大腸菌群測定》（GB/T4789.3-2003）進行檢測。因此我們應根據樣品的種類選擇正確的檢驗方法。
檢樣處理與稀釋
菌落總數和大腸菌群的測定均應在潔凈工作區進行，所用器具均需嚴格滅菌。目前微生物實驗室常用的滅菌方式主要為干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。其中干熱滅菌是利用恒溫干燥箱內160℃～180℃的高熱，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的的一種方法；濕熱滅菌是利用高壓蒸汽以及在蒸汽環境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質凝固變性而使微生物死亡的一種方法。一般玻璃培養皿、刻度吸管以及金屬取樣工具可裝入相應的不銹鋼消毒桶中，然后置于熱空氣消毒箱160℃~180℃干熱滅菌2h以提高工作效率，而含水物品如培養基、生理鹽水等則需采用濕熱滅菌的方法.。
樣品取樣前一定要核查樣品包裝的密封性和密封的完整性。檢驗人員要嚴格按照規定佩帶無菌帽子、 口罩、 手套等，操作前用酒精棉球對手部進行消毒。取樣時應注意無菌操作，一般固體樣品從其不同部位稱取25g置于225mL無菌生理鹽水中，液體樣品則吸取25mL置于225mL無菌生理鹽水中。應該注意的是，國標針對不同類別食品樣品前處理還有特殊的規定：如食醋和酸性飲料，由于呈酸性，需調節pH值至中性才能進行檢測；調味品，如醬和醬油等，由于其本身含鹽量較高，取樣及稀釋樣品時應用無菌蒸餾水；固態、半固態乳制品取樣時應將無菌生理鹽水預熱至45 ℃；冷凍食品取樣前應在 45℃以下不超過 15 min , 或 2℃～ 5℃不超過 18 h 進行解凍。
菌落總數和大腸菌群檢驗常用的稀釋液為無菌生理鹽水和磷酸鹽緩沖液，一般情況下兩者可以通用，無任何區別。然而，對于一些酸性或堿性樣品，使用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，更利于樣品中微生物的存活和檢出[[[] 孫慧, 李天添. 使用不同稀釋液對食品中菌落總數檢測結果的影響初探[J]. 釀酒, 2012, 39(1):86-88.]]。在制備10倍系列稀釋樣品勻液過程時，我們應根據樣品受污染程度，以及產品的微生物限度選擇稀釋的最低倍數。比如國標對液態飲料菌落總數限度要求：n=5, c=2, m=100CFU/mL, M=10000CFU/mL，這時稀釋到1：100就可以判斷產品是否合格；而糕點國標菌落總數規定：n=5, c=2, m=10000 CFU/g, M=100000 CFU/g，這時就要稀釋到1：1000測定才能進行判斷；在盲樣測定時，由于不知道樣品具體菌落數，這時為保險起見應多做稀釋度，一般至少稀釋到10-8才能達到計數的目的。在稀釋過程中，每遞增稀釋一次需更換一根無菌吸管或吸頭，保證稀釋倍數的準確性，同時應取空白稀釋液做陰性對照， 因為空白對照如果有細菌生長，說明培養基、稀釋液、培養皿滅菌及人員操作中至少有一項未滿足實驗要求，檢測結果無效，應逐一排查查明原因。
接種與培養
在菌落總數檢驗接種時，應該揭開培養皿的部分使檢液從側邊進入。檢液加入后，必須盡快傾注培養基混勻。傾注培養皿的培養基應保持46℃，因為溫度過高培養皿中的細菌可能被燙死而影響結果的準確性，溫度過低培養基將凝固。當培養皿中瓊脂凝固后，將培養皿置于培養箱中36℃±1℃倒置培養48h±2h（水產品為30℃±1℃培養72h±3h），培養皿倒置培養的原因主要有3個：1.防止培養皿正置培養時水分蒸發在培養蓋上形成冷凝水滴落而污染培養基；2.倒置培養后瓊脂表面不會有水膜，從而促使菌落的形成；3.倒置培養后菌落生長速度適宜，形成的菌落容易計數。
在大腸菌群檢驗過程中，平板法接種注意事項和菌落總數測定相似，也包括培養基傾注的溫度保持46℃，培養皿倒置培養。但是在使用MPN法測定前要注意杜氏扣管里是否有空氣，以免影響后續的觀察，增加工作量。在接種時應注意，當樣品接種體積>1mL（一般為10mL）時應使用雙料培養基，而接種量≤1mL應用單料培養基，這是因為接種體積的增大會稀釋培養基使各成分濃度降低，因而使用雙料培養基。
在大腸菌群MPN法糖發酵實驗中，觀察是否產氣應對光傾斜觀察，有時杜氏扣管中會出現比米粒還小的氣泡干擾檢驗人員，這時可通過觀察發酵液是否渾濁，繼續培養是否產氣來判斷。對于GB/T 4789.3-2003，亦可通過觀察發酵液是否變黃進行判斷，以確定是否進行下一步實驗。為保證實驗結果準確性，應同時做陰性對照、陽性對照試驗。當發現樣品初發酵陽性時，必須進行證實試驗，因為有許多研究表明，初發酵實驗陽性的試管，證實試驗結果可能為陰性。
在大腸菌群平板法驗證試驗中，可疑菌落的挑取驗證往往是檢驗人員認為比較棘手的問題。國標規定，挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，少于10個全部挑取，這句話常常讓檢驗人員不知如何理解。其實這里的典型菌落主要包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌，建議檢驗人員初次實驗時取這四種細菌進行陽性對照試驗，然后注意觀察，并記錄典型大腸菌群形態，這樣就能區分出典型菌落和可疑菌落。正式試驗時，挑取典型菌落和可疑菌落各10個（或全部挑?。┻M行驗證，挑取菌落時可連同部分培養基挑出，以防漏挑。
計數結果
菌落總數和大腸菌群的計數一般按照國標規定執行即可。然而，在實際檢驗工作中常常會遇到菌落蔓延整個培養皿而導致無法計數的情況。筆者結合近幾年的檢驗經驗認為可以從以下幾個方面解決此問題。首先，無論是菌落總數還是大腸菌群測定，都可以在凝固后的瓊脂表面覆蓋3~4mL相應的培養基防止菌落蔓延；其次，可以多做稀釋度，在高稀釋倍數計數；再次，培養過程中應每天觀察，在菌落蔓延前作出記錄。特殊的，對于菌落總數測定，特殊情況下，還可以嘗試在平板計數瓊脂里面加入TTC（氯化三苯四氮唑），TTC檢測的原理是大部分細菌在代謝的過程中能產生脫氫酶，具有脫氫作用，可將無色的TTC還原，使菌落顯紅色，便于計數，同時抑制大片蔓延菌落的形成[4,5]。但在使用過程中應嚴格控制TTC的濃度，否則影響菌落計數。
在菌落總數和大腸菌群測定計數時，有時會遇到無法區分殘渣微粒和菌落的情形。這時應仔細觀察，尋找殘渣與菌落的區別：一般殘渣形狀不規則，而菌落則相對規則；殘渣顏色暗淡，而菌落則相對明亮。另外還可通過延長培養時間進行判斷，因為如果為細菌，通常會繼續生長。對于菌落總數測定還可以通過多接種一個平板，傾注瓊脂后將其放到0℃-4℃冰箱中，待計數時作為對照；或者添加TTC使細菌染成紅色進行計數。
此外，在菌落總數和大腸菌群計數時，還可能出現高稀釋倍數培養皿細菌數與低稀釋倍不成10倍關系，或高稀釋倍數培養皿細菌數高于低稀釋倍數，這可能是檢驗過程操作有誤或者樣品中還含有防腐劑，此時的計數結果不應作為報告結果的依據。
培養基的保存
在菌落總數和大腸菌群測定時，所用培養基是影響測定結果的一個至為關鍵的因素，所有培養基都應該符合GB 4789.28-2013標準要求。一些常用的培養基如平板計數瓊脂、LST肉湯（月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯）、乳糖膽鹽發酵管，如果一次不能完全用完，可置于4℃冰箱，一般可保存兩周。平板計數瓊脂可且只能融化一次使用，過多融化將影響實驗結果；大腸菌群平板法中，VRBA（結晶紫中性紅膽鹽瓊脂）應在使用前3小時內制備，以防受到污染。
結語：
食品質量安全與人們的健康生活息息相關，習近平總書記曾對食品質量安全工作作出重要指示，提出要堅持“最嚴謹的標準、最嚴格的監管、最嚴厲的處罰、最嚴肅的問責”。作為一名基層食品微生物檢驗人員，在食品檢測技術日益發展的今天，更應該與時俱進，深刻掌握檢驗的相關原理以及注意要點。在菌落總數和大腸菌群時，要做到每一步驟操作精細準確，這樣才能保證檢驗結果準確可靠，為我國食品安全監管貢獻出力量。
參考文獻
[1]王 嘉. 2019年上半年市場監管總局共公布不合格食品256批次，這七大類問題企業要關注 [N]. 中國質量報
[2]楊慶文, 國譯丹, 周惠新, 等. 不同濃度 TTC 平板計數瓊脂細菌生長試驗觀察[J]. 中國衛生檢驗雜志
[3]孫慧, 李天添. 使用不同稀釋液對食品中菌落總數檢測結果的影響初探[J]. 釀酒
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傅志豐1 周鶴2 許文蓓1
?。?.九江市食品檢驗檢測中心, 江西 九江，332000；2.九江市食品藥品檢驗所, 江西 九江，332000）
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