器材 高效液相色譜-串聯質譜儀(Waters TQ-S),酶標儀(ThermoFisher multiskan);離心機(Lynx 6000),渦旋振蕩器(pro250),氮吹儀。

　　試劑 硝基呋喃檢測試劑盒(COKDA0300)，AOZ標準溶液(Sigma-Aldrich公司)，60%甲醇，1mol/L鹽酸，50mmol/L2-硝基苯甲醛二甲基亞砜溶液，0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液，1mol/L氫氧化鈉，20%甲醇溶液，1mol/L鹽酸，2-硝基苯甲醛亞甲基二砜溶液。

　　實驗 供試品溶液：HPLC-MS法：稱取2g樣品，加10mL60%甲醇勻漿2min，離心后棄去上清液，加8mL甲醇洗滌1次，8mL乙醇洗滌1次，8mL乙醚洗滌1次。取標準溶液AOZ使其最終濃度0.5、1、2、4、10ng/mL。每個離心管加入水4mL、1mol/L鹽酸1mL、50mmol/L2-硝基苯甲醛溶液0.15mL，混勻。37℃避光16h。加0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液5mL，用1mol/L氫氧化鈉調PH=7.2~7.4。加乙酸乙酯5mL，渦旋5min。離心后取上清液于50℃氮氣吹干。加20%甲醇溶液0.5mL溶解，濾過待測。

　　ELISA法：取勻質后的樣品1g，加水4mL，1mol/L鹽酸0.5mL，10mmol/L2-硝基苯甲醛溶液。37℃置16h，加0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液5mL，加1mol/L氫氧化鈉0.4mL和乙酸乙酯5mL，渦旋30s，離心后取上清液，60℃下氮氣吹干，加正己烷1mL和稀釋液1mL，渦旋1min，離心后去下層50uL，待測。

　　ELISA法：微孔板回溫，分別加標準品和樣品50uL，所有微孔加入25 uLAOZ-HRP，25 uLAOZ抗體溶液，密封?；靹蚍跤?h后倒掉溶液重復3次加300 uL緩沖液，沖洗緩沖液的步驟，加150 uLTMB底物避光孵育30min，加50 uL終止液，放入酶標儀在λ=450和630nm下讀數。

　　測定 HPLC-MS法 液相色譜條件：色譜柱Waters BEH(2.1 mm×50 mm，1.7μm);柱溫:30℃。進樣體積：5.0μl;流速：0.25 ml/min。流動相：0.1%乙酸水(A)和乙腈溶液(B)，梯度洗脫：0min，80%;A=8.5min，A=40%;11min，A=10%。

　　質譜條件：電離方式ESI(+);毛細管電壓1.5 KV;離子源溫度120℃;錐孔反吹氣氮氣100 L/h;去溶劑氣氮氣溫度350℃;去溶劑氣流量800 L/h;碰撞氣氬氣流速0.25 ml/min。m/z=236/134的錐孔電壓和碰撞電壓為25V和13eV，m/z=236/104的錐孔電壓和碰撞電壓為25V和18eV。

　　結果 27份樣品使用兩種方法進行檢測后，定性結果相同。37份檢測結果均為陰性，陽性檢出率達到0%，樣品合格率為100%。方法的回收率和精密度見表一。

　　表一 AOZ添加回收率和精密度(n=6)

　　方法 添加量

　　(ug/kg) 測得量

　　(ug/kg) 回收率

　　(%) 相對標準偏差

　　(%)

　　HPLC-MS法 0.5 0.473 94.6 6.7

　　1.0 1.065 106 7.2

　　5.0 4.621 92.4 7.9

　　ELISA法 0.5 0.578 116 10.6

　　1.0 0.812 81.2 14.9

　　5.0 4.049 8.10 17.4

　　本文對27份樣品進行檢測，將HPLC-MS法來作為對照方式，對比ELISA法的檢測結果。兩種檢測方法的定性結果相同，但是HPLC-MS有較好的回收率和精密度。ELISA法由于孵育溫度和時間需要精準控制，在大批量樣品處理時，可能會影響其結果準確度。因此，HPLC-MS是作為測定魚肉中硝基呋喃的確證、定量的最可靠方法。

　　雖然ELISA法只是半定量檢測方法，但由于其檢測限低、易于操作等優勢，外加其不受到其他成分干擾，非常適合在批量普查工作中初篩，這對于實驗室快速初篩定性魚肉中的硝基呋喃有積極作用。

　　馬青青 許文清

　　河南省疾病預防控制中心 鐵道警察學院