王海鳳，胡江波，許夢婷，唐賽賽

(山東中醫藥高等?？茖W校，山東煙臺 264199)

摘 要：目的：探討香菇多糖(LNT)與阿霉素(ADR)聯合應用對胃癌SGC7901細胞凋亡及耐藥基因表達的影響。方法：CCK8法檢測不同濃度香菇多糖對胃癌SGC7901細胞增殖的影響，確定非細胞毒性香菇多糖的濃度;將胃癌細胞株SGC7901分為空白對照組、ADR組、ADR+LNT組，流式細胞儀檢測香菇多糖與阿霉素聯合應用對SGC7901細胞凋亡的影響;實時熒光PCR檢測香菇多糖與阿霉素聯合應用對耐藥基因ZNF139、MRP-1和MDR1的轉錄表達的影響。結果：確定30 μg/mL香菇多糖為最大非細胞毒性濃度進行后續實驗;與空白對照組及ADR組比，ADR+LNT組SGC7901/ADR細胞凋亡率明顯增

加(P<0.05);與空白對照組比，ADR組ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表達明顯升高(P<0.01)，ADR+LNT組MRP-1基因的表達明顯降低;與ADR組相比，ADR+LNT組ZNF139、MRP-1基因的表達明顯降低(P<0.01)。結論：香菇多糖與阿霉素聯合應用可促進胃癌SGC7901細胞凋亡，抑制耐藥基因ZNF139、MRP-1的表達，逆轉胃癌SGC7901細胞對阿霉素耐藥性。

關鍵詞：香菇多糖;阿霉素;胃癌SGC7901細胞;凋亡;耐藥基因

香菇是起源于我國的世界第二大食用菌[1]。香菇多糖(Lentinan，LNT)是一種從香菇中提取的活性成分，是純化的β-1,3-葡聚糖[2]。目前，香菇多糖在臨床上被廣泛用于腫瘤的輔助治療。腫瘤耐藥性的產生是導致治療失敗的主要原因，逆轉腫瘤耐藥性是提高腫瘤治療療效的關鍵。本研究以胃癌細胞SGC7901為模型，探討香菇多糖聯合阿霉素對胃癌細胞凋亡及耐藥基因表達的影響，為香菇多糖抗腫瘤作用機制提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC7901購自上海美軒生物科技有限公司。

1.2 試劑

香菇多糖(批號1902271)、注射用鹽酸阿霉素(ADR)(25 mg，批號：G1823064)、RPMI-1640完全培養基(KGM31800S-500)、CCK8法細胞增殖檢測試劑盒(KGA317)、Trizon Reagent(CW0580S)、Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒(CW0581M)、HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒(CW2569M)、UltraSYBR Mixture(CW0957M)，均購自北京康為世紀生物科技有限公司;Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit(AP105-100kit)購自MULTI SCIENCES公司。

1.3 儀器

CO2培養箱(BPN-80CW)，上海一恒科學儀器有限公司;倒置熒光顯微鏡(MF53)，廣州市明美光電有限公司;多功能酶標儀(02L3006)，TECAN;熒光PCR儀(CFX Connect™實時)，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;低溫高速離心機(TGL-16D)，常州中捷實驗儀器制造有限公司;NovoCyte™流式細胞儀(NovoCyte 2060R)，艾森生物(杭州)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 CCK8法檢測香菇多糖對SGC7901細胞增殖的影響

實驗設7組，分為空白對照組、6個不同濃度香菇多糖實驗組。取對數生長期SGC7901細胞以1×104個/孔接種于96孔板的100 μL培養液中，培養至貼壁約70%。實驗組向完全培養基中按20%的比例加入用RPMI1640培養液稀釋的不同濃度的香菇多糖，使其終濃度依次為10 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，空白對照組加等體積培養液，每組設3個復孔，培養48 h，每孔加入10 μL CCK8檢測溶液，再置于培養箱中孵育4 h，振蕩混勻，在酶標儀上于波長450 nm處讀取光密度值(OD值)，重復實驗3次，計算細胞生長率，見式(1)。以生長率大于90%的最高藥物濃度作為非細胞毒性濃度，作為后續實驗的給藥量。

細胞生長率=(實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.4.2 細胞造模及分組

取對數生長期SGC7901細胞，棄去細胞培養上清，用1×PBS洗兩遍，用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化，離心、洗滌、重懸，按40%比例將細胞接種于6孔板，待細胞完全貼壁后，棄去上清，設空白對照組、阿霉素組(ADR組)、阿霉素和香菇多糖聯合用藥組(ADR+LNT組)?？瞻讓φ战M加培養液1 000 μL，ADR組向SGC-7901細胞中加入含ADR(5.0 μg/mL)的培養液1 000 μL，ADR+LNT組向SGC-7901細胞中加入含ADR(5.0 μg/mL)與20%香菇多糖(終濃度為上述非細胞毒性濃度)培養液1 000 μL，培養48 h后進行流式檢測和PCR檢測。

1.4.3 流式細胞儀檢測阿霉素與香菇多糖聯合用藥對細胞凋亡的影響

收集1×106～3×106個細胞，加1 mL PBS，1 500 r/min離心3 min，洗2遍，用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer，取300 μL預冷的1×Binding Buffer重懸細胞。每管各加入3 μL的Annexin V-APC和5 μL的7-AAD，混勻后，室溫避光孵育10 min，再向每管中加入200 μL預冷的1×Binding Buffer，上機檢測。

1.4.4 qPCR檢測香菇多糖對多藥耐藥相關基因的影響

按試劑盒說明書，抽提各組SGC7901細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以GAPDH為內參，計算出各組ZNF139、MRP-1、MDR1的相對表達量。ZNF139、MRP-1、MDR1引物序列見表1。

反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。每個實驗重復3次取平均值，檢測各組SGC7901細胞內ZNF139、MRP-1、MDR1表達情況。

1.4.5 統計學分析

2 結果與分析

2.1 不同濃度香菇多糖對SGC7901細胞增殖的影響

由表2可知，30 μg/mL香菇多糖(生長率93.3%)為非細胞毒性濃度，作為后續實驗的給藥量。

2.2 香菇多糖對SGC7901細胞凋亡率的影響

由表3可知，與空白對照組比，ADR組和ADR+LNT組SGC7901細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。與ADR組相比，ADR+LNT組SGC7901細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。

2.3 香菇多糖對SGC7901細胞耐藥基因表達的影響

由表4可知，與空白對照組比，ADR組ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表達明顯升高(P<0.01)，ADR+LNT組MRP-1基因的表達明顯降低。與ADR組相比，ADR+LNT組ZNF139、MRP-1基因的表達明顯降低(P<0.01)，MDR1表達有降低趨勢但無顯著性差異。

3 討論

化療可有效遏制胃癌細胞的增殖，但在化療中胃癌細胞多藥耐藥(MDR)的產生常導致化療效果不佳[3]。阿霉素是廣譜抗腫瘤藥物，其本身毒性較大，但治療效果明顯，至今依然沿用。2017年阿霉素被世界衛生組織國際癌癥研究機構統計在致癌物清單中，所以減少用量以及與其他抗癌藥物聯用成了新的研究趨勢。

本實驗通過不同濃度香菇多糖對SGC7901細胞增殖的影響發現(表2)，低濃度香菇多糖(10 μg/mL)對SGC7901細胞增殖有一定的促進作用，當香菇多糖濃度達到30 μg/mL時開始抑制細胞增殖，當香菇多糖濃度達到100 μg/mL及以上時可顯著抑制SGC7901細胞增長<0.05、<0.01)，表明香菇多糖必須達到一定的藥物濃度方能起到抗腫瘤作用。通過流式檢測細胞凋亡實驗發現(表3)，香菇多糖聯合阿霉素應用可明顯誘導胃癌SGC7901細胞凋亡的發生，說明香菇多糖與阿霉素聯合應用可促進胃癌細胞凋亡的發生，為阿霉素聯合用藥提供實驗依據。

介導腫瘤耐藥的蛋白包括P-糖蛋白(P-Glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(Multidrug Resistance-Associated Protein，MRP)、鋅指蛋白(ZNF)等[3-5]。本研究通過qPCR檢測各組胃癌細胞SGC7901耐藥相關基因ZNF139、MDR1、MRP的表達，結果顯示(表4)，與空白對照組比較ADR組ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表達明顯升高(<0.01)，表明阿霉素可通過促進胃癌細胞耐藥基因的表達導致化療失敗。與空白對照組相比ADR+LNT組MRP-1基因的表達明顯降低，與ADR組相比ADR+LNT組ZNF139、MRP-1基因的表達明顯降低(P<0.01)，MDR1表達有降低趨勢但無顯著性差異，表明香菇多糖與ADR聯合應用可抑制SGC7901/ADR細胞多藥耐藥相關基因ZNF139、MRP-1的表達。

4　結論

本研究初步表明香菇多糖可抑制胃癌SGC7901細胞的增殖，與阿霉素聯合應用可促進SGC7901細胞凋亡，亦可抑制胃癌SGC7901細胞耐藥基因ZNF139、MRP-1的表達而逆轉化療中對阿霉素耐藥的發生。

參考文獻

[1]唐慶九,王淑蕾,王晨光,等.香菇子實體中單核苷類成分研究[J].食品與生物技術學報,2017,36(3):283-286.

[2]張晶,蘇暢,賈英杰,等.香菇多糖抗腫瘤治療臨床應用進展[J].天津中醫藥,2019,36(11):1137-1140.

[3]陳磊,唐圣松.P-糖蛋白在乳腺癌多藥耐藥中的作用及其調控機制[J].中國生物化學與分子生物學報,2014,30(3):248-254.

[4]劉光,丁華野,皋嵐湘,等.乳腺癌中Vimentin與P-糖蛋白表達和其它預后指標的相關性研究[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2001,10(2):179-181.

[5]戴金鋒,蔡利軍,陳超英,等.溫郁金逆轉胃癌SGC7901/VCR多藥耐藥性機制的研究[J].中國中西醫結合雜志,2014,34(12):1507-1511.

基金項目：山東省高等學?？蒲杏媱濏椖?ldquo;香菇多糖逆轉胃癌SGC7901/ADR多藥耐藥的實驗研究”(J18KB124)。

作者簡介：王海鳳(1980—)，女，漢族，山東煙臺人，碩士，副教授。研究方向：腫瘤基礎研究及醫學檢驗教學。