袁　夢，胡　莎，葛文靜

(青島市糧油質量檢測和軍隊糧油供應中心，山東青島 266042)

摘　要：目的：評定高效液相色譜-串聯質譜儀測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的不確定度。方法：依據《糧油檢驗 主要谷物中16種真菌毒素的測定 液相色譜-串聯質譜法》(LS/T 6133—2018)進行實驗，按照《測量不確定度評定與表示》(JJF 1059.1—2012)分析測定過程的不確定度來源，建立數學模型計算合成不確定度和擴展不確定度。結果：小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量為1 930 μg/kg，其擴展不確定度256 μg/kg(=95%，=2)。結論：影響本次測定過程的不確定度主要包括重復檢測、標準溶液純度及配制、樣品制備、DON同位素內標和高效液相色譜-質譜聯用儀。儀器引入的不確定度分量對本次評定影響最大。

關鍵詞：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;高效液相色譜-串聯質譜儀;不確定度

真菌毒素廣泛的存在于食品和飼料中，全球都普遍面臨著真菌毒素污染的重大問題，嚴重威脅著人類和動物的生命安全[1-2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是一種是單端孢霉烯族毒素，具有較強的熱抵抗力和耐酸性[3]，食用了DON污染的食物后，可對人和動物的腸道、大腦及神經系統產生毒害作用，使動物產生厭食和嘔吐反應等急性中毒癥狀[4]，嚴重時損害造血系統造成死亡[5-7]，因此DON又稱嘔吐毒素[8-11]。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯系的參數。測量不確定度通常包括很多分量[12]。其中一些分量是具有統計性的，另一些分量是具有非統計性的。為得到準確、可靠和科學的實驗數據，不確定度的評定具有重要作用。DON含量的定量分析結果應包括測量值和測量不確定度，能更準確地反映脫氧雪腐鐮刀烯醇的濃度。本次實驗采用《糧油檢驗 主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯質譜法》(LS/T 6133—2018)[13]測定小麥中DON的含量，參照《測量不確定度評定與表示》(JJF 1059.1—2012)[14]，建立DON不確定度的評定方法，分析在檢測過程中產生的不確定度分量[15-16]，對各分量進行計算得到合成標準不確定度、擴展不確定度，以及各分量的相對貢獻，能夠為更準確、科學的評定檢測結果提供依據。

1　材料與方法

1.1　儀器與試劑

1290-6460超高液相色譜-串聯質譜儀(美國Agilent公司);DT300A百分之一分析天平(江蘇省意歐儀器儀表有限公司);3-18ks離心機(德國Sigma公司);C18色譜柱(Agilent公司，100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。

DON標準液濃度(濃度為100.6 μg/mL，不確定度為1.2 μg/mL，Pribolab公司);13C15-脫氧雪腐鐮刀烯醇同位素內標(13C15-Deoxynivalenol，13C15-DON，濃度為25 μg/mL，不確定度為0.2 μg/mL，Pribolab公司);乙腈、甲醇、乙酸銨、乙酸(分析純，美國Merck公司)。

樣品提取液：乙腈-水-乙酸混合液(70︰29︰1，V︰ V ︰ V，自行配制)。

1.2　實驗方法

1.2.1　液相色譜-串聯質譜儀色譜條件

儀器條件柱溫35 ℃;進樣量：1 μL;流速：0.20 mL/min;流動相：A為1%乙酸溶液和5 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為甲醇;流動相梯度洗脫條件見表1。

1.2.2　高效液相色譜-串聯質譜儀質譜條件

電離模式：電噴霧電離源(ESI)負離子模式;毛細管電

壓：4 kV(+)，3.5 kV(-);脫溶劑氣溫度：350 ℃;脫溶劑流量：10 L/min;碰撞氣體：氬氣;掃描模式(scan type)：多反應監測模式(MRM);駐留時間：30 ms，質譜條件參數見

表2。

1.2.3　標準溶液配制

配制標準溶液的稀釋液為乙腈-水-乙酸(35︰64.5︰0.5，︰︰)混合液。

100.6 μg/mL的DON標準液配制得到10 μg/mL的DON標準儲備液，然后經過稀釋得到1.5 μg/mL的DON標準工作液，稀釋1.5 μg/mL的DON標準液得到一系列濃度標準工作液，濃度分別為37.5 μg/mL、75 μg/mL、150 μg/mL、375 μg/mL和1 500 μg/mL的標準溶液。準確吸取0.8 mL的13C15-DON內標液于10 mL容量瓶中，定容至刻度線，得到2 μg/mL的13C15-DON同位素內標標準工作液。

1.2.4　樣品前處理

粉碎小麥樣品，過500 μm孔徑試驗篩，混勻。準確稱取5 g(精確到0.01 g)小麥樣品于50 mL離心管，加入20 mL提取液，渦旋或振蕩提取30 min，然后用離心機6 000 r/min離心10 min，吸取0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL超純水，旋渦混勻，在4 ℃以下12 000 r/min離心10 min，上清液過0.2 μm的聚四氟乙烯濾膜，收集濾液A。

1.2.5　添加13C15-DON同位素內標液

準確吸取180 μL濾液A或者標準系列工作曲線于進樣小瓶中，加入20 μL之前配制好的13C15-DON同位素內標工作液，旋渦混勻，上機待測。

1.2.6　樣品檢測與計算

按照上述方法以及儀器條件測定樣品，經過液相色譜-串聯質譜聯用儀上機檢測，以DON系列標準工作液各點濃度與13C15-DON內標液濃度之比為橫坐標(x軸)，以DON系列標準工作液各濃度的峰面積與13C15-DON內標液的峰面積之比為縱坐標(y軸)，以各個數值點做最小二乘線性擬合做工作曲線(1)：

式中：X- 待測樣品中 DON 含量，單位為 μg/kg;x- 待測樣品溶液中待測毒素與內標的濃度比;r- 待測毒素對應的內標濃度，單位為 μg/kg;V- 加入提取液的體積，20 mL;f-提取液稀釋因子，為 2;m- 待測樣品稱量質量，單位為 g。

2　結果與分析

2.1　測量不確定度的來源分析

根據CNAS-GL006-2019化學分析中不確定度的評估指南，上述數學模型和檢測方法操作步驟，測定小麥中DON的不確定度來源于以下幾個方面：待測樣品檢測重復性引入的不確定度;標準曲線系列工作液配制過程引入的不確定度;標準曲線系列工作液擬合產生的不確定度;樣品制備前處理過程中引入的不確定度;內標引入的不確定度;檢測方法及儀器設備引入的不確定度。

2.2　各不確定度分量的分析和評定

2.2.1　重復檢測引入的不確定度評定

重復檢測引入的不確定度屬于A類不確定度。實驗室日常檢測，無法將所有的樣品進行前處理，這就會引起檢測結果的不準確，因此只能通過混勻粉碎混勻，盡量確保樣品的均勻性，增加檢驗次數，盡量減少樣品的不均勻性引起的實驗誤差。為了評定重復性檢測的不確定度分量，分別稱取6份小麥樣品，經過前處理上機檢測計算得到質控樣品的濃度，結果見表3。

2.2.2　標準溶液引入的不確定度評定

標準溶液引入的不確定度來源主要包括標準品純度引入的相對標準不確定度、配置系列標準曲線工作液時產生的相對標準不確定度、不同濃度的標準曲線線性擬合產生的相對標準不確定度。

(1)標準溶液純度引入的不確定度評定。經查本次實驗使用的DON標準液標品證書，DON標準液濃度為100.6 μg/mL，其擴展不確定度為1.2 μg/mL(包含

(2)配制系列標準曲線工作液時產生的不確定度評定。用1.00 mL移液管移取1.00 mL的100.6 μg/mL的DON標準液于10 mL容量瓶，定容至刻度線，得到10 μg/mL的DON標準儲備液。用有1 mL移液槍分兩次移取1.5 mL的DON標準儲備液于10 mL容量瓶，定容至刻度線，得到1.5 μg/mL的DON標準工作液，分別移取2.5 mL、1 mL、0.5 mL、

0.25 mL的1.5 μg/mL DON標準工作液標準液到10 mL容量瓶中，分別得到37.5 μg/L、75 μg/L、150 μg/L、375 μg/L和1 500 μg/L的標準液。經查10 mL容量瓶20 ℃時最大允誤=0.020 mL，;1 mL移液管20 ℃時最大允差為=0.008 mL，，1 mL移液槍20 ℃時相對最大允許誤差為=1%，，配制過程不同移液器相對不確定度見表4。

不同濃度的標準曲線線性擬合產生的不確定度評定。按照方法對不同濃度的 DON 系列標準液共檢測 5 次，根據表 5，測得的數據進行線性擬合得到線性方程 y=1.034 24x+0.036 26，相關系數 R=0.999 97，參與標準曲線的點 n=5，標準曲線的重心(2.137 5，2.246 9)，即 c—=2.137 5。

待測樣品上機檢測 6 次，由標準曲線計算得到待測樣品平均 DON 濃度為 c—，則通過標準曲線擬合引入的標準不確定度為：

2.2.3　樣品制備過程中引入的不確定度評定

2.2.4　13C15-DON同位素內標引入的不確定度評定

2.2.5　高效液相色譜-質譜聯用儀引入的不確定度評定

經查高效液相色譜-質譜聯用儀儀器計量鑒定認證證書，儀器的擴展不確定度是u=11%，k=2，因此此儀器的相對不確定度

2.3　內標法測定小麥中DON含量的合成不確定度

高效液相色譜-質譜聯用儀內標法測定小麥中DON的不確定度分量包括重復檢測引入的不確定度、標準溶液引入的不確定度、樣品制備過程中引入的不確定度、DON同位素內標引入的不確定度、高效液相色譜-質譜聯用儀引入的不確定度。合成DON含量的相對標準不確定度：

各不確定度分量對合成相對標準不確定的相對貢獻大小見表6。

由表4可知，儀器引入的不確定度相對貢獻最大，其次是配制標曲、樣品前處理過程、重復性檢測、同位素內標引入的不確定度，標準曲線線性擬合引入的不確定度最小。

取置信水平為 95%，k=2，因此擴展不確定度為 U= k×u×c=2×0.066 40×1 930=256 ug/kg。高效液相 - 質譜聯用儀內標法測定小麥中 DON 的含量結果為(1 930±256)μg/kg(k=2)。

3　結論

高效液相色譜-質譜聯用儀內標法測定小麥中含量的不確定度評定最終結果表示為(1 930±256)μg/kg(k=2)，擴展不確定度為256 μg/kg。本次測定過程的不確定度分量中，高效液相色譜-質譜聯用儀引入的不確定度分量為

0.055 00，對合成不確定度的影響最大，其次是配制標曲、樣品前處理過程、重復性檢測、同位素內標引入，而標準曲線線性擬合引入的不確定度分量為對結果的影響最小。

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作者簡介：袁夢(1987—)，女，江蘇吳縣人，碩士，工程師。研究方向：糧油檢測。