張　楊

(廣元市產品質量監督檢驗所，四川廣元 628000)

摘　要:目的：為使各微生物實驗室達到比較一致的檢驗質量和質控水平，發現食品安全抽檢工作中存在的問題，提高檢驗結果的準確度和可信性，參加2020年度由四川省市場監督管理局組織的盲樣考核工作。方法：依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》(GB 4789.3—2016)第二法大腸菌群平板計數法對盲樣進行大腸菌群定量分析。結果：該盲樣的大腸菌群數為4.0×104 CFU/mL，結果評價為滿意。結論：此次盲樣考核對微生物檢驗能力和檢驗過程各個環節質量控制的提高有重要作用。

關鍵詞：盲樣考核;大腸菌群;質量控制

大腸菌群是世界上大多數國家和組織評價食品衛生質量的重要安全性指標之一，因和腸道致病菌有密切的相關性，大腸菌群在食品微生物指標體系中占有重要地位，被稱為糞便污染指示菌[1]。2020年度四川省市場監督管理局組織開展食品安全監督專項抽檢，其中28批次大腸菌群不符合食品安全國家標準，主要不合格產品為瓶裝飲用水、糕點、調味品、餐具等。大腸菌群超標反映出食品企業衛生狀況不達標，可能與加工原料受污染、產品的滅菌不徹底、衛生操作規范執行不嚴格、包裝材料受污染等原因有關[2]。食品微生物實驗室的常規檢驗項目包含大腸菌群檢驗，是絕大部分食品都會要求檢驗的項目。檢驗大腸菌群方法有很多種，本次盲樣考核要求采用平板計數法，適用于大腸菌群含量較高的食品。

1　材料與方法

1.1　盲樣來源和保存

由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心下發玻璃瓶包裝的凍干塊狀樣品，樣品到達實驗室后，按盲樣考核作業指導書要求立即放入-15 ℃以下的冰箱中保存。

1.2　培養基試劑和儀器設備

本次盲樣考核中使用的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(以下簡稱VRBA)、煌綠乳糖膽鹽肉湯(以下簡稱BGLB)均由青島海博生物技術有限公司提供，并進行性能試驗且在有限期內，符合使用要求。

生化培養箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、生物安全柜等。

1.3　方法

按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》(GB 4789.3—2016)第二法大腸菌群平板計數法進行檢驗[3]。

1.3.1　樣品制備

需要用總計40 mL滅菌生理鹽水再水化，即本次凍干的樣品等同于40 mL的食品樣品。首先從冰箱中取出盲樣使其達到室溫后，將西林瓶無菌開啟，立即加入4 mL滅菌生理鹽水進行再水化，凍干塊狀樣品溶解后，放入準備的無菌錐型瓶中，再反復用余下的生理鹽水清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述無菌錐型瓶中，此溶液為待測樣品原液[4]。

1.3.2　樣品稀釋

用無菌吸管吸取25 mL待測樣品原液，放入盛有225 mL無菌生理鹽水中振搖，充分混勻，制成1︰10的樣品勻液。用1 mL無菌吸管吸取1︰10樣品勻液1 mL注入9 mL無菌生理鹽水試管中，混合均勻，制成1︰100的樣品勻液，按上述操作以此類推稀釋至1︰10 000。每稀釋一次，換一根無菌吸管。

2　結果與分析

2.1　平板計數

吸取1︰10～1︰10 000稀釋度樣品勻液1 mL于無菌平皿中，每個稀釋度做2個無菌平皿，同時取1 mL無菌生理鹽水加入無菌平皿中作空白對照。將平皿中倒入融化并恒溫46 ℃的VRBA瓊脂15～20 mL，并小心轉動平皿，混合均勻，待瓊脂凝固后，再加入3～4 ml VRBA覆蓋平板表層，翻轉后置于(36±1)℃培養24 h。結果見表1。

2.2　菌落的選擇和證實試驗

經培養后，VRBA平板上均出現0.5～3 mm紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環的菌落。由表1可知，只有1︰1 000稀釋度的菌落數在計數范圍之內，從1:1 000稀釋度的兩個VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落分別接種到BGLB肉湯管中，(36±1)℃培養48 h后10支BGLB肉湯管均出現產氣現象。

2.3　大腸菌群平板計數的報告

該盲樣的大腸菌群數為：

40×10/10×103 mL=4.0×104 CFU/mL。

2.4　項目結果評價

本次食品中大腸菌群(定量)檢測項目盲樣考核結果評價為滿意。

3　結論與討論

(1)參加考核前，要認真閱讀盲樣考核作業指導書，按其要求對待測樣品進行前處理。由于食品中微生物的數量和種類會隨著環境的改變而出現消長，故食品微生物盲樣樣品很少提供食品實物，多數為人工模擬樣品的凍干粉形式出現。對于定量項目來說凍干塊的樣品為一個樣品單元，它是一個不可分割的整體，不能僅用一部分來檢驗，其次樣品的均勻性也會對檢驗結果造成直接影響，因此要在無菌條件下將樣品充分混勻后隨機取樣。

在日常檢驗工作中首先需根據產品選擇適當的檢測方法，若食品中大腸菌群含量較低，可選擇半定量計數MPN法，而大腸菌群較多的食品則可以選擇定量計數平板法[5]。其次，要選擇合適的稀釋度，稀釋度越高，檢驗人員的工作量越大，稀釋度選擇太低，平板上的菌落數又多不可計算?！妒称钒踩珖覙藴?食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》(GB 4789.3—2016)中要求選擇2～3個適宜的連續稀釋度，但作為盲樣考核，為了保證數據的準確性，需要根據實際情況多選擇幾個稀釋度，同時檢驗過程中盡量選取雙人雙平行同步檢驗，減少人員誤差。

(2)培養基對目標微生物檢出的準確性起重要作用，使用培養基時應嚴格按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》(GB 4789.28—2013)進行制備和驗證。結晶紫中性紅膽鹽瓊脂作為選擇性培養基是不需要進行滅菌的，煮沸2 min即可使用，該培養基需現配現用，不得超過3 h。在檢驗過程中，為防止有遷徙性細菌生長蔓延，對觀察結果造成影響，必須待第一次傾注的VRBA凝固后，再將其覆蓋一層，其目的是隔絕空氣，降低需氧菌生長速度。

為了提高大腸菌群的檢出率這就要求平時要多觀察VRBA平板上大腸菌群的不同形態，并挑取菌落進行BGLB肉湯管證實試驗，這樣才能對大腸菌群的各種形態了然于心，防止檢驗工作中錯檢漏檢。

(3)驗證試驗時，為了降低檢驗過程中的誤差，挑取菌落時需注意典型菌落和可疑菌落的比例?！妒称钒踩珖覙藴?食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》(GB 4789.3—2016)要求選取菌落數在15～150 CFU的平板，挑取10個不同類型典型和可疑菌落，少于10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落進行BGLB發酵驗證試驗，但是并未說明每個平板挑取10個還是兩個平板總共挑取10個。如果平板上菌落形態單一，則兩個平板總共挑取10個進行驗證，若平板上菌落形態差異較大，則最好是每個平板上挑取10個菌落進行驗證，并且對典型和可疑菌落按照比例挑取驗證，最終計算結果時，還需要分別計算典型菌落的陽性率和可疑菌落的陽性率。

提高實驗室質量控制是為了確保檢驗工作的準確性，為產品質量評價提供可靠的依據。積極參加盲樣考核和能力驗證活動，是對實驗室技術能力和管理狀況進行考核的方法之一，也是保證實驗室資質質量的重要手段，對實驗室質量控制十分重要。

參考文獻

[1]雷蘭蘭.食品微生物能力驗證的重要因素[J].現代食品,2018(12):4-6.

[2]唐軼君,張建軍,李晶,等.水中銅綠假單胞菌盲樣考核結果與分析[J].生物化工,2017(3):46-49

[3]中華人民共和國國家衛生和技術生育委員會.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數:GB 4789.3—2016[S].北京:中國標準出版社,2016.

[4]辛雙陽,董慶林,何天文.淺析食品中大腸菌群檢測能力驗證的質量控制[J].食品安全導刊,2021(15):72.

[5]郭軍明,孫煥芝,侯秀珍,等.對VRBA大腸菌群平板計數法的試驗改進及研究[J].農業技術與裝備,2021(5):28-29.