□ 王銀平 吳瑩 劉軍 張群 淄博市疾病預防控制中心

摘　要：本文對一起疑似食物中毒事件中所采集的樣本進行病原學檢測分析，希望能夠為預防食物中毒提供科學依據。應用全自動醫用PCR分析系統對22種常見胃腸道感染相關病原體進行快速篩檢，以實時熒光定量PCR技術進行毒力基因檢測，并利用傳統方法對病原菌進行分離培養。檢測數據顯示，35份樣本的22種常見胃腸道感染相關病原體檢測結果為檢出致病性大腸埃希菌(EPEC);10份樣本經實時熒光定量PCR技術檢出EPEC毒力基因escV和內參基因uidA;經傳統培養分離方法，最終從6份糞便樣本中分離出目標菌EPEC。因此得出結論，綜合流行病學調查、臨床癥狀和實驗室檢驗結果，推斷出這是一起由攜帶EPEC的食堂工作人員通過污染食物導致學生感染發病的突發公共衛生事件。建議各級衛生監督部門加強對餐飲行業及其從業人員的監督檢查力度，避免類似食物中毒事件的發生，進而保障人民的身體健康。

關鍵詞：致瀉性大腸埃希菌 食物中毒 實時熒光PCR 毒力基因

食源性疾病是指人體因攝食有毒有害物質(包括生物性病原體)等致病因子所引發的疾病，無論是在發達國家還是發展中國家其都是目前最為突出的公共衛生問題之一[1]。2020年6月，山東省淄博市某學校發生一起疑似食物中毒事件——6月29日~7月2日，該校陸續有30余人出現嘔吐、惡心、腹痛、腹瀉(多為水樣便，3~6次/天)等消化系統癥狀。經流行病學調查發現，發病患者均曾在該校食堂就餐，共同暴露食品為西紅柿炒雞蛋、炸蝦、稀飯等，除一名患者為食堂內部工作人員外，其余均為學生，且共同進餐人數約200人。本實驗采用全自動醫用PCR分析系統對采集樣本混合樣進行22種常見胃腸道感染相關病原體快速診斷，結果判定為致瀉大腸埃希菌，然后利用實時熒光PCR技術對所有樣本進行致瀉大腸埃希菌初篩檢驗，同時進行樣本中致瀉大腸埃希菌的增菌培養、分離鑒定。結果證實，導致本次食物中毒事件的病原體是攜帶毒力基因escV和內參基因uidA的EPEC。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及標本來源

本次事件共采集樣本35份，其中，患者糞便23份、肛拭子7份、可疑食物3份(炸蝦、肉夾饃、西紅柿炒雞蛋)、熟食刀和熟食砧板涂抹物各1份。將被采集樣本裝入無菌采樣容器后進行編號，然后立即送至市疾控實驗室進行病原微生物檢驗。質控菌株為聚集性大腸埃希菌(EAEC)CMCC24186、產毒性大腸埃希菌(ETEC)CMCC10667、致病性大腸埃細菌(EPEC)CMCC24189、侵襲性大腸埃希菌(EIEC)CMCC10662、出血性大腸埃希菌(EHEC)CMCC24187，均由山東省疾病預防控制中心提供。

1.1.2 主要儀器

FilmArray全自動醫用PCR分析系統，法國梅里埃診斷產品(上海)有限公司;ABI QuantStudio 5實時熒光PCR儀，美國ABI公司。

1.1.3 主要試劑

胃腸道感染檢測試條(FilmArray G1 Panel)，法國梅里埃診斷產品(上海)有限公司;5種致瀉性大腸桿菌核酸檢測預分裝試劑盒(熒光PCR法)，深圳生科原生物股份有限公司;營養肉湯、EE肉湯、麥康凱瓊脂培養基、腦心浸液瓊脂培養基等，北京陸橋有限公司，以上試劑均在有效期內使用。

1.2 方法

1.2.1 全自動醫用PCR分析檢測

按照胃腸道感染檢測試條(FilmArray G1 Panel)操作說明對被采集樣本混合樣預處理后，進行22種常見胃腸道感染相關病原體的快速診斷。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測

按照5種致瀉性大腸桿菌核酸檢測預分裝試劑盒(熒光PCR法)操作說明，應用ABI QuantStudio 5實時熒光PCR儀對35份樣本進行5種致瀉大腸埃希菌12種特異性基因檢測。

1.2.3 致瀉性大腸埃希菌的分離培養

依據《食品安全國家標準 食品衛生微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》(GB/T 4789.6-2016)和《山東省食源性疾病主動監測工作手冊》(2020年版)，對所采集樣本進行致瀉大腸埃希菌的增菌、分離和鑒定(肛拭子和糞便不增菌，直接進行分離和鑒定)。

2 結果

2.1 全自動醫用PCR分析系統檢測結果

使用全自動醫用PCR分析系統對所有樣本的混合樣進行22種常見胃腸道感染相關病原體檢測，結果為檢出致瀉大腸埃希菌，具體型別為致病性大腸埃希菌(EPEC)，詳見表1。

2.2 實時熒光定量PCR檢測結果

選擇FAM、HEX/VIC/JOE、ROX、CY5這4個熒光通道分別對A/B/C管反應液進行熒光采集(見表2)，記錄Ct值。樣本檢測結果判定：Ct值≤35，有明顯指數增長，為陽性;Ct值在35~38范圍，需對其重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35~38范圍，且有明顯指數增長，則判定為陽性，否則為陰性;Ct值>38或無Ct值，判定為陰性。參照表3對35份樣本的Ct值進行判讀，最終判定結果為10份樣本(2份肛拭子、8份糞便)初篩EPEC陽性，見表4。

2.3 致瀉性大腸埃希菌的分離培養

依據全自動醫用PCR分析檢測結果和實時熒光定量PCR初篩檢測結果，明確引起本次疑似食物中毒事件的病原菌為EPEC。對采集樣本進行增菌培養后(肛拭子和糞便不增菌，直接進行分離和鑒定)，劃線至麥康凱瓊脂培養基繼續培養24h，挑取玫紅色可疑菌落劃線至腦心浸液瓊脂培養基，培養得到菌株純培養物。然后，再次應用實時熒光PCR技術對獲得的菌株純培養物進行5種致瀉性大腸埃希菌的12種特異性基因復核鑒定，最終從6份糞便標本中分離出攜帶毒力基因escV和內參基因uidA的EPEC菌株。

3 討論

致瀉性大腸埃希菌(Diarrheagenic Escherichia coli，DEC)是一類能夠引起人體以腹瀉為主要癥狀的大腸埃希菌，其可通過污染食物引起人體患病。根據毒力因子、致病機理和流行病學特征可將DEC分為5類，即侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、產毒性大腸埃希菌(ETEC)、致病性大腸埃希菌(EPEC)、出血性大腸埃希菌(EHEC)和聚集性大腸埃希菌(EAEC)。有文獻資料顯示，近年來，國內已多次出現由致瀉性大腸埃希菌引起的食物中毒事件[2-5]。

學校作為一個特殊的公共場所，人員較為密集且流動性大，一旦疏忽了對食品安全的日常監管，放松了對食堂工作人員食品安全責任意識的培養，極易引起食源性疾病的暴發與流行。在此次食物中毒事件中，由于采集的樣本數量有限等原因，未能從食物樣本和刀板涂抹物樣本中檢出病原菌。值得注意的是，本次事件中有一名患者是該學校食堂內部的工作人員，其發病時間比其他學生患者早2~3天，且該患者肛拭子樣本經PCR初篩為EPEC陽性，由此推斷病原菌EPEC可能是食堂工作人員污染了食物，再經污染的食物感染了多名學生。

本次事件中，35份樣本經實時熒光PCR檢測初篩EPEC陽性共10份，經增菌培養分離，最終從6份樣本中分離出EPEC菌株，其余4份PCR初篩陽性樣本未分離到目標菌株。究其緣由，可能是因為PCR技術靈敏度較傳統方法高，而肛拭子、糞便等樣本中背景菌群龐大、對目標菌的分離存在干擾;同時，患者服用藥物也會影響目標菌的存活量及存活狀態，這些因素都對目標病原菌的培養分離產生較大影響。與傳統的病原菌分離培養方法相比，多重PCR技術和實時熒光PCR技術可以對疑似食物中毒事件的病原體進行快速定性，并減少后續工作量。

鄧艷華對食品和公共場所從業人員致瀉性大腸埃希菌攜帶情況的一項研究[6]表明，在所有受檢人員中，致瀉性大腸埃希菌的檢出率明顯高于沙門氏菌、志賀菌的檢出率。由此可見，在食品從業人員的預防性健康體檢項目中，增加致瀉性大腸埃希菌的檢測具有一定的可行性和必要性。

實驗室快速、精準的現代化檢測技術在此次食物中毒事件的處置應對中發揮了至關重要的作用，為控制病情贏得了寶貴時間，患者發病后得到了及時的對癥治療，病情得以好轉，沒有造成嚴重的后果。食品和公共場所從業人員需提高安全責任意識，采購時選用新鮮食材，加工時做到生熟分開，及時消毒，并嚴格控制環境溫度、濕度等條件，抑制病原菌繁殖，以有效預防食物中毒事件的發生，更好地保障人民群眾舌尖上的安全。

參考文獻：

[1] 陳艷，嚴衛星.國內外急性胃腸炎和食源性疾病負擔研究進展[J].中國食品衛生雜志，2013，25(2):190-193.

[2] 吳玉廷，劉安梅，秦毅.一起由致病性大腸埃希菌引起的食物中毒[J].中國公共衛生，2004，20(6):686-686.

[3] 陳國渝，陳先紅.一起致病性大腸埃希菌引起的食物中毒的檢測[J].中國社區醫師(醫學專業)，2012，14(19):256.

[4] 齊瑩瑩.86例細菌性食物中毒患者微生物學檢驗結果分析[J].河南預防醫學雜志，2018，29(12):928-929.

[5] 王鴿，申屠平平，朱珈慧.2014年金華市食源性疾病監測結果分析[J].中國食品衛生雜志，2017，29(01):97-100.

[6] 鄧艷華.食品和公共場所從業人員致瀉性大腸埃希菌攜帶情況分析[J].實驗與檢驗醫學，2015，33(02):161-162.