□ 賈南南 李建平 范美霞 菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院

摘　要：本文旨在建立實時熒光PCR檢測熟牛肉中牛、豬、馬等動物源性成分的方法。通過對菏澤市市售熟牛肉進行采樣檢測，提取熟牛肉中總DNA后進行實時熒光PCR檢測，確定Ct值，分析樣品熟牛肉中牛、豬、馬源性成分。通過檢測DNA提取液(純度1.6~1.7)，便能滿足實時熒光PCR的檢測要求。本次采樣檢測的12批樣品中，2批既檢出牛源性成分又檢出馬源性成分，說明樣本可能存在馬肉摻假為牛肉的問題。

1 引言

隨著社會的發展，人們的生活水平不斷提高，對肉制品的要求也越來越高。但是，肉制品市場存在肉類摻假、以次充好等欺騙消費者的行為，不法商販為了追求自身利益以“掛羊頭賣狗肉”的方式用劣質肉冒充高質量的肉制品。利用常規的檢測方法只能從感官及形態上鑒別肉類，無法從溯源層面解決肉類摻假的問題，例如對于腌制加工的熟牛肉，消費者就很難通過肉眼辨別其是否為牛肉。

隨著分子生物學的發展，以DNA為基礎的PCR技術被廣泛應用于動物源性成分的檢測[1-4]，即聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)溯源是以DNA遺傳物質為基礎鑒別肉及肉制品。聚合酶鏈式反應是一種在體外特異性擴增DNA序列的技術，其基本過程為3個階段的多次循環——模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火、在DNA聚合酶引導下的鏈延伸反應，且每一次循環后的擴增產物均可作為下一輪循環的模板。就理論而言，擴增產物量呈指數形式上升，即經過n個循環后，產物量增加到2n倍。此方法在動物源性成分檢測、肉類摻假鑒別等應用上已有多個報道[7，8]。本研究針對菏澤市市場上銷售的肉及肉制品進行抽樣檢測，利用實時熒光PCR方法鑒別牛、豬、馬源性成分，以期發現是否存在摻假的情況，旨在為肉制品摻假檢測提供一定的參考依據。

2 材料和方法

2.1 材料

12份市售熟牛肉。

2.2 儀器

絞肉機，小熊電器股份有限公司;金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司;Rotor Gene Q 熒光定量PCR儀，德國凱杰。

2.3 試劑

無水乙醇，天津市富宇精細化工有限公司;DNA提取試劑盒，天根生物公司;豬源性檢測試劑盒、牛源性檢測試劑盒，Takara公司;馬引物及探針(SN/T3730.5-2013)、PCR體系預混液2xTaqMan Fast qPCR Master Mix(Probe qPCR)，上海生工合成。

2.4 樣品處理

取適量樣品放入燒杯中，用溫水沖洗并擠干水分，往復數次，用干凈的絞肉機粉碎，備用。

2.5 樣品總DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書進行操作。

2.6 DNA純度與濃度

打開核酸蛋白檢測儀，吸取 DNA溶解液2μL加入加樣口，分別測定260nm與280nm吸光度，測定DNA提取液的濃度和純度。

2.7 聚合酶鏈式反應(PCR)

2.7.1牛源性實時熒光PCR反應

以提取的各個DNA樣品為模板，按牛源性檢測試劑盒說明書操作。

圖 1 牛源性成分檢測

2.7.2 豬源性實時熒光PCR反應

以提取的各個DNA樣品為模板，按豬源性檢測試劑盒說明書操作。

圖 3 豬源性成分檢測

2.7.3 馬成分檢測

以提取的各個DNA樣品為模板，作陽性對照、陰性對照、空白對照。

反應體系：2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 10μL、10μM Forward Prime 0.4μL、10μM Reverse Primer 0.4μL、10μM probe 0.4μL、DNF Buffer 2μL、模板DNA 1μL、dH2O 5.8μL。

反應條件：預變性94℃3min，變性94℃5s，退火延伸60℃30s(收集熒光信號)，40個循環。

圖 2 馬成分檢測

3 結果與分析

3.1 DNA模板質量

所有樣品DNA提取液OD260/OD280值為1.6~1.7，濃度為50~100ng/μL，模板DNA在純度及濃度上都能夠滿足進行PCR檢測的要求。

3.2 實時熒光PCR 檢測結果

分別配制牛、豬源性熒光PCR反應體系和馬成分熒光PCR反應體系，Ct值如表1所示。當樣品的Ct值不為0且小于35，并有典型的擴增曲線時，則判定樣品檢出該動物源性成分;反之則為未檢出該動物源性成分。

4 討論

動物源性食品大多為動物組織，其結構緊密，富含蛋白質、脂肪等大分子物質，而熟肉制品在制作過程添加了入味調料等，這些物質會在DNA提取過程中產生共沉淀，倘若提取不當將會影響后續PCR檢測。因此，在提取DNA的過程中，去除雜質，得到高DNA純度尤為重要。本方法在前處理時用溫水多次洗滌，去除入味的香料和鹽等成分，DNA提取采用試劑盒介質吸附法(硅基質)，DNA純度高，雜質等抑制物少，是PCR成功的保證。檢測結果顯示，所抽取的市售12批樣本中均檢出牛源性成分，2批既檢出牛源性成分又檢出馬成分，說明樣本可能存在馬肉摻假為牛肉的問題。

參考文獻：

[1] 陸俊賢，唐修君.利用熒光定量PCR技術鑒別畜禽肉中豬源性成分[J].食品研究與開發，2017，38(10):110-112.

[2] 陳果.實時熒光PCR檢測鴨血中的動物源性成分[J].食品安全質量檢測學報，2019，10(11):3339-3342.

[3] 苗麗，李志娟等.肉制品中牛源性成分熒光定量聚合酶鏈式反應方法的建立與應用、[J].肉類研究，2015，29(9):30-33.

[4] 曹際娟，盧行安等.實時熒光PCR技術檢測肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].生物技術通訊，2002，13(2):158-160.

[5] Ballin N Z,Vogensen F K,Karlsson A H..Species determination-can we detect and quantify meat adulteration[J].Meaat Science,2009,83(2):165-174.

[6] 高丹丹，陳燕等.動物制品基因組DNA的提取和純化[J].食品科技，2007，1(8):30-33.

[7] 石盼盼，魏法山等.4種方法提取牛肉干DNA的效果比較[J].食品安全質量檢測學報，2016，7(7):2920-2925.

[8] 何海寧，洪霞等.實時熒光PCR技術檢測肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].食品與機械，2015，31(6):79-83.

[9] 劉輝，楊利萍，張濱.PCR及其改進技術在食品檢測中的應用[J].食品與機械，2008，24(4):166-169. [11] 國家企業信用信息公示系統http://www.gsxt.gov.cn/index.html.