□ 趙德錕 杭州大微生物技術有限公司

本文介紹了一種創新的智能厭氧培養系統——以數字化精確控制厭氧培養氣體環境的生成，并且具備對多種創新的培養環境進行平行研究(同時生成：多種氣體、多種濃度、多種溫度可選)的能力。此外，還展望了該系統在食用益生菌相關研究領域包括益生菌制品活菌計數、耐氧益生菌菌株馴化、益生菌生產工藝質控、微生物培養組學(culturomics)、中藥類保健食品成分的腸內生物轉化、腸道微生物體外模型這6大細分領域的應用前景。

DW-100A-K智能厭氧微生物培養系統是業內率先實現數字化精確控制厭氧培養氣體環境(0~15%氧氣濃度可調)生成，并且可實現多個獨立培養罐體中同時進行多種培養環境(多種氣體、多種濃度、多種溫度可選)平行研究的厭氧菌培養研究平臺。目前，該系統廣泛應用于臨床致病厭氧菌檢測、益生菌和腸道菌群(多數為厭氧菌)研究，以及食品安全厭氧污染菌檢測等領域。在此，筆者展望了智能厭氧培養系統在益生菌相關研究中的應用前景。

1 酸乳等益生菌制品中的活菌計數

益生菌酸奶是目前市面上較為常見的活性益生菌制品之一，它是在常規發酵乳的基礎上添加了一種或幾種乳酸菌類(如嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌)的酸乳，具有平衡和改善胃腸道功能、增強人體自身免疫能力等特點。然而，此類酸乳的特殊營養作用和保健功能取決于其成品中是否含有足夠數量級的活性益生菌，因此統計各種益生菌制品的活菌總數成為判斷益生菌酸奶品質好壞和功能活性高低的重要手段。

GB 6321-2003《乳酸菌飲料衛生標準》和GB 9302-2010《發酵乳》中均對產品中乳酸菌數量有所要求，即≥1×106cfu/mL。目前，我國關于活性益生菌產品中的活菌計數主要參考GB 4789系列食品安全國家標準食品微生物檢驗方法中有關乳酸菌和雙歧桿菌的標準執行。在此方法中，穩定可靠的厭氧培養環境是保證活菌計數結果準確的基礎，也是產品品質保障的關鍵。

DW-100A-K智能厭氧培養系統的工作原理是通過內置精密無油真空泵、毫巴級壓力傳感器和軟件控制系統來自動控制氣體的抽排與置換，從而保證所連接的培養罐內數分鐘即達到厭氧、微需氧或特定氧濃度設定的氣體培養環境。然后，將設定好的氣體環境培養罐與主機分離，再置于任意溫度的恒溫培養箱中進行培養。智能厭氧培養系統在益生菌制品的活菌計數實驗過程中提供了穩定、專業的厭氧培養條件，提高了計數結果的準確性和穩定性，為益生菌制品企業的品控提供了技術支撐。同時，該系統也可應用于市場監管部門的監督檢驗活動中。

2 耐氧優良益生菌菌株的馴化選育

益生菌種類繁多，其中雙歧桿菌無疑是最具發展潛力的一類益生菌。雙歧桿菌可用于調節人體的腸道微生物，且具有治療腹瀉、緩解乳糖不耐癥和降低血清、膽固醇等作用。然而，由于雙歧桿菌為嚴格厭氧菌，且缺少有效的活性氧清除機制，故一些活性氧成分會導致細胞的死亡。因此，篩選出具有優良耐氧性的雙歧桿菌，將極大地促進其在益生菌制品中的應用。

耐氧型雙歧桿菌的獲取一般需通過3步完成——分離、鑒定和馴化。首先是對各類樣品進行處理，即在厭氧條件下培養、分離;然后通過鑒定手段以確定獲取的菌株是否為雙歧桿菌;最后使雙歧桿菌菌株在厭氧環境和微需氧環境下交替培養，多次傳代后即可獲得耐氧型雙歧桿菌。在此過程中，厭氧環境的形成和逐級氧氣濃度梯度馴化(見圖1)對耐氧型菌株的獲取有非常重要的影響。DW-100A-K智能厭氧培養系統可精確、高效地實現氧氣濃度從0~15%的梯度控制，并實現厭氧與微需氧環境的轉化，從而增加耐氧型菌株陽性率。

3 益生菌制劑的生產工藝優化和工藝質控

在微生態理論指導下，采用已知的有益微生物，經培養、發酵、干燥等特殊工藝制成的生物制劑或活菌制劑被稱為益生菌制劑。優質的微生態制劑應具備如下標準：

①活菌量應達到107~1010個/g;

②菌株應穩定、安全、可靠;

③菌株能在腸道內存活、繁殖，且具有抗環境變化的能力;

④制劑應能長期儲存，且在有效期內不低于標示的活菌數。

以益生菌產品生產為例，生產過程主要由種子培養、投料接種、大罐發酵、菌液處理與凍干、益生菌產品的穩定性評價五大基本步驟組成。在此過程中，接種量、氧氣濃度、培養溫度是保證益生菌產品品質的重要影響因素，因此采用智能厭氧培養系統可精準實現各種微生物的生長環境，更好地確定加工流程與加工條件，確定產品加工過程中的質控點與要求，以保證產品品質。同時，該系統可同步實現在相同環境條件下的不同溫度加速試驗，從而更準確地對產品進行穩定性評價。

4 微生物培養組學(culturomics)研究領域

近年來，隨著宏基因組技術的發展，人們對腸道菌群的菌群結構和功能的認識不斷加深，但是對原核生物的純培養卻逐漸被忽視，而純培養對于闡明這些微生物的功能和分離潛在益生菌而言是不可或缺的。因此，通過培養組學(culturomics)技術培養人體腸道菌群中從前無法培養的細菌受到科學界的廣泛關注。培養組學使用多種培養條件促進較難培養的菌株生長，結合MALDI-TOF質譜和16S rRNA測序等技術，以鑒定細菌等微生物;通過利用培養組學，至少被分離一次的腸道物種增加了一倍。近年來，培養組學的應用不僅使可培養的人體細菌增加了幾百種，其還能用于分離潛在的益生菌，是研究細菌療法的基礎。利用DW-100A-K智能厭氧培養系統的多種培養環境平行研究(同時生成：多種氣體、多種濃度、多種溫度可選;靈活：多種罐體，獨立培養，避免交叉污染)的能力(如圖2)，并結合多種培養基組合，將有助于提升培養組學技術平臺的多重培養分離能力。

5 中藥類保健食品成分的腸內生物轉化研究領域

生物轉化技術是指通過應用植物細胞、微生物或酶等生物體系對天然活性化合物進行合成與結構修飾的過程，進而起到增效減毒、產生活性成分等作用。該技術是開發中藥及中藥類保健食品的有效途徑。

研究表明，在人和動物腸內菌叢中約99%是厭氧性細菌，利用微生物智能厭氧系統可模擬人腸內厭氧條件和菌叢組成，大量培養人體腸內厭氧性細菌，并將酶與保健食品中的中藥類成分在37℃厭氧條件下共溫培養，可實現生物轉化過程。與此同時，通過建立相應的轉化模型和標準操作規程，并結合轉化產物與原形化合物的結構特點，還可推斷轉化機制，有利于尋找、合成有活性的天然產物及其衍生物，以對其進行深入的研究。

6 腸道微生物體外模型研究領域

在目前的研究過程中，建立合理且易操作的腸道微生物體外模型對推動腸道微生態學、人體和動物營養學的發展意義非凡。采用DW-100A-K智能厭氧培養系統，可根據胃、小腸、升結腸、橫結腸等腸道部位的溫度、氧氣濃度、pH值等條件特點，在不同的獨立培養罐中分別構建腸道微生物體外研究模型，因而更好地模擬腸道和研究外界因素(如益生菌、益生元等)對腸道微生物菌群的影響。同時，由于該系統提供精準的平行研究平臺，最大程度保證了條件的一致性，通過連續發酵培養，將各模型進行整合，可幫助尋找出最佳的培養篩選條件，以實現對不同腸道段中微生物的靶向培養分離。