超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑殘留量

□ 李垚辛 南充市食品藥品檢驗所

摘　要：本文建立了高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞肉中兩種硝基咪唑代謝產物——羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的分析方法。樣品經乙腈提取，正己烷除脂，Retain-CX固相萃取柱凈化，以0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相梯度洗脫，C18色譜柱分離，正離子模式電噴霧電離，多反應監測(MRM)測定雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑含量。在5.0~200ng/mL范圍內，兩種代謝物的線性關系良好，相關系數(r2)大于0.997，檢出限為0.13~0.16μg/kg，定量限為0.43~0.53μg/kg，在1.0μg/kg、5.0μg/kg、10μg/kg這3個加標濃度下的回收率為76.0%~109.8%，相對標準偏差為2.7%~14.5%(n=6)。這說明，該方法準確、高效，適用于雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的檢測。

關鍵詞：雞肉 液相色譜-串聯質譜法 固相萃取 羥基甲硝唑 羥甲基甲硝咪唑

1 引言

硝基咪唑類藥物是一類應用廣泛的人工合成的具有5-硝基咪唑基本結構的化合物，常用藥物主要有甲硝唑、地美硝唑和洛硝噠唑等。此類藥物能殺滅和預防厭氧菌及病原蟲，可用于治療與預防家禽的滴蟲病、球蟲病、豬密螺旋體性痢疾及動物的各種厭氧菌感染[1]。由于硝基咪唑類藥物含有的硝基雜環類化合物存在細胞誘變性，因此具有潛在的動物致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性，其藥物殘留對動物源性食品安全構成了直接威脅，故被許多國家列為違禁藥物[2]。我國農業部235號公告明確規定，甲硝唑和地美硝唑允許用作治療藥物，但不得在動物性食品中檢出;洛硝達唑禁止使用且不得在動物性食品中檢出[3]。羥基甲硝唑(MNZOH)是甲硝唑(Metronidazole)的代謝產物，羥甲基甲硝咪唑(HMMNI)是地美硝唑(Dimetridazole)和洛硝達唑(Ronidazole)的代謝產物。建立以上兩種硝基咪唑代謝物的分析方法對于防控動物源性食品安全風險，監測硝基咪唑類藥物使用及殘留情況具有重要意義。

目前，關于硝基咪唑類藥物的檢測方法主要有酶聯免疫法[4]、高效液相色譜法[5-6]、氣相色譜法[7]、氣相色譜-質譜法[8]、液相色譜-質譜或串聯質譜聯用法[9-12]等。雖然我國制定了一些相關的檢測標準[14-16]，但大部分方法的檢測限相對較高，且主要針對硝基咪唑類原藥，對于其代謝物的檢測研究較少。本文采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)，分別對液相條件和質譜條件進行了優化，建立了雞肉中羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑的檢測方法，以期為實驗室日常檢測和監管硝基咪唑類藥物在食品中的濫用提供技術支持。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1290液相色譜、6420三重串聯四極桿質譜聯用儀，美國Agilent公司;ML203/02分析天平(0.001g)，上海Mettler Toledo公司;XS205DU分析天平(0.01mg)，上海Mettler Toledo公司;固相萃取小柱(HYPERSEP RETAIN-CX，60mg/3mL)，美國Thermo公司;均質機，中國?？乒?離心機，德國Eppendorf公司。

試劑：甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸銨(色譜純)，美國Thermo公司;羥基甲硝唑標準品，德國Dr公司;羥甲基甲硝咪唑標準品，德國WITEGA公司;實驗室用水為Milli-Q超純水。

產品：市售雞肉。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品前處理

稱取均質試樣5g(精確到0.01g)置于50mL離心管中，加入5mL飽和氯化鈉溶液和15mL乙腈，均質提取1min，4000r/min離心5min。然后，將上清液轉移至100mL雞心瓶中，再用15mL乙腈重復提取殘渣兩次。合并上清液至同一雞心瓶中，40℃旋轉蒸發至近干，加入5mL0.1%甲酸水溶液和5mL正己烷，混勻離心后，棄去正己烷層，待凈化。

Retain-CX固相萃取柱使用前依次用3mL甲醇、3mL水、3mL0.1%甲酸水活化，將待凈化液以1~2mL/min的速度過柱，用3mL0.1%甲酸水、3mL甲醇淋洗小柱，最后用3mL5%氨水甲醇分兩次洗脫，收集洗脫液于40℃氮氣下吹干，用1mL初始流動相溶解殘渣，過0.22μm濾膜，待上機。

2.2.2 標準溶液的配制

稱取羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑標準品，用甲醇稀釋成1μg/mL的混合標準工作液。稱取6份空白樣品，按最終定容濃度5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL分別加入混合標準工作液，余下按樣品處理步驟制備基質加標標準系列。

2.2.3 儀器條件

2.2.3.1 液相條件

安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm);0.1%甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B;流速：0.3mL/min;進樣體積：10μL;柱溫：40℃;洗脫程序：30%B(0~0.5min)，30%~90%B(0.5~3min)，90%B(3~7min)。

2.2.3.2 質譜條件

離子源：ESI+;檢測方式：多反應監測(MRM);干燥氣溫度：300℃;干燥氣流量：10L/min;霧化氣壓力：40psi;毛細管電壓：4000V;目標物質譜參數見表1。

3 結果與分析

3.1 線性范圍、檢出限和定量限

將基質加標標準系列注入液相色譜-質譜聯用儀中，以質量濃度為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y建立線性回歸方程，結果表明，羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑濃度在5~100ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.997。

用標準系列第1點測得信噪比，結果見圖1、圖2。以信噪比(S/N)=3時的含量定為方法的檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)=10時的含量定為方法的定量下限(LOQ)，結果見表2。

3.2 回收率與精密度

稱取空白樣品，添加混合標準溶液，添加水平為1.0μg/kg、5.0μg/kg、10μg/kg，每個水平做6個平行，得到回收率和精密度，結果見表3。羥基甲硝唑的回收率為76.0%~109.8%，相對標準偏差(RSD)為4.6%~14.5%;羥甲基甲硝咪唑的回收率為78.2%~105.6%，相對標準偏差(RSD)為2.7%~9.0%。

3.3 實際樣品分析

采購了不同地點的10份市售雞肉樣品進行檢測，均未檢出羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑這兩種硝基咪唑類代謝物。

4 結論

本文采用乙腈提取，正己烷脫脂，固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯質譜檢測，建立了雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑殘留的分析方法。該方法操作簡便，準確性好，靈敏度高，適用于實驗室日常檢測，也為硝基咪唑類藥物監測提供了技術支撐。

參考文獻：

[1] 魏云計，朱臻怡，馮民，何健，沈金榮，何正和，秦嫻，張伶俐，錢怡平，丁濤等.高效液相色譜-串聯質譜快速測定飼料中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留[J].分析測試學報.

[2] 丁燕玲，陳彤，黃婷，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中甲硝唑、二甲硝唑及其代謝物的方法研究[J].廣東化工，2018，45(13)：245-24.8.

[3] 中華人民共和國農業部第235號公告，2002.

[4] 張弛，潘家榮，帥瑞琪，方豪，馮依.動物性食品中硝基咪唑類獸藥多殘留酶聯免疫檢測方法的建立[J].核農學報，2016，30(2):0323-0331.

[5] 王揚，鄭重鶯，何豐，葉磊海.高效液相色譜法測定羅非魚肌肉中硝基咪唑類多組分殘留量[J].食品科學2011，32(20).

[6] 于敏，張美娟，張河霞，烏恩其木格，王丹慧，武慧明，秦培林，高效液相色譜法測定牛奶中硝基咪唑類殘留量[J].食品安全質量測學報，2018，9(2)，447-451.

[7] 劉波，黃為紅，王金中.氣相色譜一電子捕獲檢測器同時檢測硝基咪唑類藥物[J].分析科學學報，2008，24(5):586–588.

[8] 汪紀倉，馬素英，王大菊，等.氣相色譜一離子阱串聯質譜法同時測定豬肌肉中硝基咪唑類藥物殘留[J].畜牧獸醫學報，2008，39(12):1772–1778.

[9] 方力，邱鳳梅，余新威，張志超.基質分散固相萃取-液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品中硝基咪唑藥物及其代謝物[J].色譜，2018，36，(5)：431-438.

[10] 黎翠玉，吳敏，嚴麗娟，曾三妹，徐敦明，周昱.高效液相色譜-串聯質譜測定動物源性食品中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量[J].食品安全質量檢測學報2012，3(1)：17-22.

[11] 高海榮.二氧化鋯QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜測定魚肉中2種硝基咪唑及代謝產物[J].食品工業科技，2019，40(4)：266-270.

[12] 勵炯，孫嵐，王紅青，邱紅鈺，康健.分散固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中的5種硝基咪唑類藥物殘留[J].分析測試學報，2017，36(11)：1357-1362.

[13] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T 21318-2007動物源性食品中硝基咪唑類殘留量檢測方法[S]北京:中國標準出版社，2007.

[14] SN/T 1928-2007 進出口動物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法[S]，2007.

[15] GB/T 21318-2007 動物源性食品中硝基咪唑殘留量檢驗方法[S]，2007.

[16] 農業部1025號公告-22-2008 動物源食品中4種硝基咪唑殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法[S]，2008.