□ 楊麗霞 長沙市食品藥品檢驗所

摘　要：本文的目的是建立一種運用電化學免疫傳感器快速檢測金黃色葡萄球菌的方法。該傳感器采用微間隙陣列電極作為基礎電極，運用雙抗夾心酶聯免疫反應和酶催化銀沉積反應實現分析信號放大。該方法特異性良好，對非目標菌株無交叉反應，檢出限為104CFU/mL，線性范圍為104~108CFU/mL，傳感器的電導率與金黃色葡萄球菌濃度之間的線性關系較好，線性相關系數R2=0.947。本研究證明，電化學免疫傳感器快速檢測金黃色葡萄球菌法具有檢測速度快、操作簡便、檢測成本低等優點，為金黃色葡萄球菌的快速檢測工作提供了一種有效手段。

關鍵詞：微間隙陣列電極傳感器 金黃色葡萄球菌 酶催化銀沉淀

金黃色葡萄球菌是革蘭式陽性球菌中最為常見的一種，其廣泛存在于自然界，可引起食物中毒、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎等疾病[1]。金黃色葡萄球菌是細菌性食物中毒事件的主要誘發因子[2]，因此準確快速地檢測金黃色葡萄球菌對食品安全檢測工作來說非常重要。目前，針對金黃色葡萄球菌的標準檢測方法主要是微生物培養法，但需要增菌、分離、生化鑒定等步驟，檢測時間通常在4天以上[3]。該方法基于致病菌的生長代謝，操作復雜且檢測周期較長，無法滿足現場快速、準確檢測的要求。本研究擬運用金黃色葡萄球菌特異性單、多克隆抗體，在微間隙陣列電極上包被多克隆抗體用于捕獲目標物，當目標物存在時，單克隆抗體特異性識別目標物就會形成三明治結構的免疫復合物，體系中的堿性磷酸酶可將銀離子還原，而形成的銀單質沉淀在電極表面及其間隙中。與此同時，電極間的電導率與銀單質的沉淀量呈線性關系，可實現目標物的定量分析[4]。本方法具有精準快速、操作簡便的優點，可用于金黃色葡萄球菌及其它食源性致病菌的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙門氏菌[CMCC(B)50115]、大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、阪崎腸桿菌(CICC 21561)、蠟樣芽胞桿菌[CMCC(B)63303]、單核細胞增生李斯特氏菌(ATCC 19115)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)，以上菌株均購買自相應的菌種保藏中心。

抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體、單克隆抗體，購自上?；墼派锟萍加邢薰?堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)標記的山羊抗鼠IgG、抗壞血酸磷酸酯(ascorbic acid 2-phosphatase，AAP)，購自sigma公司;AgNO3、甘氨酸，購自國藥集團化學試劑有限公司。

主要儀器：CHI760D電化學工作站，上海辰華儀器公司;LRH-250F數顯恒溫器，上海一恒科技有限公司;微間隙陣列電極傳感器件，實驗室設計[4]。

1.2 菌液準備

菌種活化后，菌液用麥氏比濁管測定其濃度，滅活后用生理鹽水稀釋制備成不同濃度的菌懸液。

1.3 試驗方法

微間隙陣列電極用無水乙醇和超純水清洗后晾干;工作芯片用5μg/mL金黃色葡萄球菌多克隆抗體包被;加入1%脫脂奶粉溶液200μL，在37℃恒溫孵育1h，封閉芯片表面未結合抗體的位點;加入滅活菌液100μL，37℃孵育1h;加入5μg/mL金黃色葡萄球菌單克隆抗體100μL，37℃孵育30min;加入AP標記的山羊抗鼠IgG 100μL，37℃孵育30min;加入含1mmol/L AAP和5mmol/L AgNO3的底物溶液100μL，37℃避光孵育10min，用超純水清洗3次，晾干后待測。

將微間隙陣列電極傳感器的電極與電化學工作站的工作電極連接，采用線性掃描伏安法在0~50mV點位范圍檢測。

1.4 特異性分析

以金黃色葡萄球菌為陽性對照，以沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7等標準菌株作為特異性檢測菌株，以PSBT做空白對照，從而驗證方法的特異性。

1.5 靈敏度分析

將金黃色葡萄球菌滅活菌液稀釋為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/mL等5個濃度梯度，以PBST作為陰性對照，通過檢測電導信號確定方法的檢測靈敏度。

2 結果與分析

2.1 檢測方法特異性

使用微間隙陣列電極傳感器檢測了8種致病菌，以測試該方法的特異性，不同菌種檢測的電導值變化見圖1。由圖1可見，只有加入金黃色葡萄球菌懸液的傳感器電導率變化明顯，空白對照和非目標菌株的電導率變化不明顯，說明該方法對金黃色葡萄球菌的特異性較高，且與其他菌株無交叉反應。

2.2 檢測方法靈敏度

金黃色葡萄球菌濃度在104~108CFU/mL范圍內變化時，其LSV響應曲線見圖2。由圖2可知，菌液濃度越高，其電導值越大，該方法的檢測限為104CFU/mL。同時，金黃色葡萄球菌濃度越高，檢測到的電導率越大，二者之間呈線性關系(如圖3)，其線性方程為：電導率(pS)=1169LogC(CFU·mL-1)-1141，R2=0.947。

3 結論

本文采用微間隙陣列電極作為基礎電極，結合雙抗夾心免疫反應構建了電化學免疫傳感器，通過電化學分析，實現了對金黃色葡萄球菌的檢測。實驗結果顯示，該方法特異性良好，檢測靈敏度可達104CFU/mL，檢測電導率和菌濃度呈正相關，線性相關系數為0.947。本方法利用堿性磷酸酶的催化作用，使銀離子還原成銀單質沉淀在電極之間，相鄰的電極被導通從而在有外加電壓時產生電流信號，電化學信號放大系統具有靈敏度高、高效、背景干擾低等優點。免疫反應采用雙抗夾心法，包被抗體為多克隆抗體，能有效捕獲目標菌株，識別抗體為單克隆抗體，有效提高了該方法的特異性。該方法將電化學生物傳感技術與免疫學方法有效結合，可以將封閉好的芯片真空干燥后密閉保存，現場試驗只需加增菌液的后續步驟，從而縮短了檢測時間，可以滿足現場檢測的需要。

參考文獻：

[1] Ding Tian, Shim Young-Hwan, Choi Na-Jung, et al. Mathematical modeling on the growth of Staphylococcus aureus in sandwich. Food Sci Biotechnol, 2010,19(3):763-768.

[2] Argudín Má, Mendoza MC, Rodicio MR. Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins 2010,2: 1751–1773.

[3] Murakami T. Filter-based pathogen enrichment technology for detection of multiple viable foodborne pathogens in 1 day. J Food Prot, 2012,75:1603–1610.

[4] 楊麗霞，邱華麗，周金沙等.基于微間隙陣列電極傳感器檢測副溶血性弧菌的方法初探.食品安全質量檢測學報.2017，8(8):3151-3155.

基金項目：國家公益性行業科研專項項目(編號：201310130);長沙市科技計劃項目(kq1801151)。