近年來不斷出現的食品安全問題成為公眾日益關注的重大公共衛生問題。高等院校招生規模逐年上升，校園后勤社會化進程對校園食品安全監管提出更高要求。為適應新形勢新矛盾，校內原有衛生力量應在遵守與執行國家正規衛生檢疫部門的管理制度的前提下，積極開展食品衛生管理改革，形成基層檢測力量，加強食品衛生前沿哨點的監測與風險評估研究與實踐。本校前身為第一軍醫大學，擁有食品、營養、微生物等專業復合型衛生人才，具備食品安檢及應急能力，建成國家認證的衛生檢測實驗中心及完善的臨床實踐服務等綜合條件，長期以來學校保持了軍隊后勤建設標準，建有一整套管理體系，對食品衛生保持高標準嚴要求，如堅持食堂采購食品公示、環境消毒、碗筷消毒、從業人員健康上崗等制度?？墒?，學校在加強自身管理之余，對采購食品和加工食品的質量監督則更多依賴于國家衛生管理體系，尚不能完全實現自我檢測上報功能。自從我校從2006年招收預防醫學食品安全方向學生起，本學科在微生物學教學科研實踐過程中一直摸索如何才能調動和提高預防醫學生的實踐及創新能力，本著學以致用的原則，組建了食品安全預防小組，開展微生物學檢測技術及實際應用相關工作，不斷探討適宜的校園或社區內食品檢測技術、評價與管理體系，為建立科學、合理的檢測和評價方法服務。本文依據國家食品衛生微生物學標準，選擇菌落總數、大腸菌群、糞大腸菌群、腸桿菌科細菌快速生化鑒定等重要評價指標，對校園內食品進行實驗研究與探討。

　　樣品采集,紫菜飯卷，早上七點隨機進高校食品店新鮮購買，該紫菜卷由紫菜包裹著已煮熟的米飯和雞蛋等材料制作而成，由漢堡包包裝紙包裝，室溫放置3h后正式實驗。儀器,冰箱：0～4℃;恒溫培養箱：35～37℃;恒溫水浴箱：45～47℃;奧林巴斯BX6050顯微鏡。培養基與試劑,營養瓊脂、乳糖微量發酵管(杭州天河微生物試劑有限公司);乳糖膽鹽發酵培養基、EC肉湯、EMB(伊紅美蘭培養基)、V-P試劑、吲哚試劑(廣東環凱微生物科技有限公司);腸桿菌科E75/15鑒定試劑盒(北京路橋技術責任有限公司);苯丙氨酸試劑(10% FeCl3水溶液)、革蘭氏染色液、0.85%生理鹽水(實驗室自制)。方法,菌落總數測定 用平板菌落計數法測定(根據國標GB/T 4789.2-2010)。大腸菌群測定 用多管發酵法測定(根據國標GB/T 4789.3-2003)。糞大腸菌群測定,將乳糖膽鹽管產酸產氣的菌液接種在EC肉湯中，在44.5℃溫度下培養，若細菌能生長并發酵乳糖產酸產氣，則糞大腸菌群的檢測為陽性。隨后將EC肉湯產酸產氣的菌液劃線接種到EMB平板中，挑選EMB平板中可疑菌落(紫黑色帶有金屬光澤的菌落)進行革蘭氏染色，油鏡觀察。腸桿菌科細菌鑒定 挑取單個菌落用腸桿菌科E75/15鑒定系統鑒定。評價標準 參照《中華人民共和國國家衛生標準》糕點、面包衛生標準-GB7099-2003進行判定。

　　菌落總數測定結果

　　紫菜卷樣品經10-1、10-2、10-3倍稀釋檢樣，菌落總數為385 CFU/g(見表1和圖1)。參照糕點、面包衛生標準-GB7099-2003國家衛生標準正常值,菌落總數值=385CFU/mL，≤1500CFU/mL,檢測食品菌落總數未超標。

　　表1 紫菜卷中菌落總數檢驗結果

　　稀釋度 實驗菌落數 平均菌落數 菌落總數CFU/g

　　10-1 30 47 38.5

　　10-2 2 4 3 385

　　10-3 4 3 3.5

　　圖1 紫菜卷菌落總數檢驗結果圖(A.10-3 B.10-1 C.10-2)

　　紫菜卷大腸菌群MPN值檢驗結果

　　待測樣品經1：10、1：100、1：1000的稀釋倍數稀釋后，每個稀釋倍數接種3管乳糖膽鹽發酵管。經過48h后，結果(表2)顯示1：10稀釋倍數接種的3管乳糖膽鹽管中有一管有產酸產氣的現象(圖2)。將該管產氣的菌液分別接種到EC肉湯和EMB平板進行培養，結果見圖3，在EMB平板上挑取兩個可疑菌落(黑色菌落)，分別做乳糖發酵試驗和革蘭染色鏡檢(圖4、5)。EMB平板分離的可疑菌落乳糖發酵實驗有產氣的現象，革蘭染色鏡檢結果為革蘭氏陰性無芽孢桿菌。結果顯示大腸菌群陽性,MPN值=400/100g。

　　表2 紫菜卷中大腸菌群MPN值檢驗結果

　　陽性管數 大腸菌群最可能數

　　(MPN)/100g 95%可信限

　　0.1mL×3

　　(10-1) 0.01mL×3

　　(10-2) 0.001mL×3

　　(10-3) 下限 上限

　　—— ——— ——— 400 <50 2000

　　1 0 0

　                        　圖2 紫菜卷中大腸菌群MPN值檢驗結果   　　(A.0.1mL×3 B.0.01mL×3)

　　                                                 圖3 EMB平板分離結果                圖4 乳糖發酵實驗結果圖 

　　                                      圖5 EMP平板分離革蘭染色鏡檢             圖6 EC肉湯培養管

　　紫菜卷中糞大腸菌群MPN值檢驗結果

　　在EC肉湯管中生長并產氣的大腸菌群陽性的結果(圖6)，可同時報告為糞大腸菌群陽性，MPN值就是大腸菌群的MPN值，故糞大腸菌群MPN值=400/100g。

　　紫菜卷中單個菌落編碼檢索結果

　　經腸桿菌科細菌E75/15生化系統鑒定結果(表3)，鑒定細菌的編碼為04222，細菌名稱為普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)。

　　表3 細菌編碼表

　　3項實驗為一組 實驗項目 實驗結果

　　(+、-) 記錄數字 記錄碼(每組帶圈的數字之和)

　　第1組 動力 - 4 2   賴氨酸 - 2   鳥氨酸 - 1

　　第2組 檸檬酸鹽 + ④ 4     硫化氫 - 2      尿 素 - 1

　　第3組 吲 哚 - 4 2    V-P + ②    苯丙氨酸 - 1

　　第4組 甘露醇 - 4 2   肌 醇 + ②    山梨醇 - 1

　　第5組 蜜二糖 - 4 2    側金盞花醇 + ②     棉子糖 - 1

　                                  　圖7 實驗前的試劑

　                                  　圖8 加菌培養后試劑(加圈-反應陽性)

　                                  　圖9 吲哚、V-P、苯丙氨酸安瓿瓶加入相應試劑后的反應   (加圈-反應陽性)

　　平板菌落總數實驗表明，實驗前應預估食品樣品中可能微生物含量，通過預實驗來確定選擇合適的3個稀釋度。正式實驗時菌落計數范圍應控制在30-300個/皿讀數內，每個稀釋度的菌落形成單位(CFU，Clony Forming Unit)應呈現相應的比例,多次測試樣品提示，選擇10、100、1000倍稀釋度可行。實驗誤差通常有：稀釋液體未充分混勻、移液量不精確、稀釋時未按要求更換移液管、稀釋加樣后未及時傾注控溫約46℃瓊脂、傾注平皿未混勻、傾注瓊脂過熱都會出現菌落數混亂不呈比例現象;動作過慢易導致瓊脂提前凝固;不同公司瓊脂在菌落色素、瓊脂凝固溫度方面有些許質量差異等。掌握方法后，可以精確進行樣品的活菌計數，平板表面和平板內都有菌生長，表面菌落大，菌落生長特征易觀察，該方法屬于準確和直觀的食品衛生質量評價指標。目前，還有更方便的3M細菌總數測試紙片法(3M PetrifilmTM)，測試中發現不能適用于所有食品，有顆粒帶顏色的食品易干擾結果判斷。大腸菌群、糞大腸菌群實驗表明，根據國家衛生標準中大腸菌群的定義，選擇實驗基本步驟為乳糖發酵陽性管→弱選擇性培養基伊紅美蘭(EMB)平板分離劃線→篩選紫黑色菌，轉種乳糖微量發酵管復發酵、接種EC肉湯44.5℃培養→EC肉湯培養物再經EMB分離→挑黑色菌經腸桿菌科生化鑒定，實驗經初發酵、復發酵、證實實驗定性是否為大腸菌群、糞大腸菌群陽性(44.5℃陽性判定為糞大腸菌群陽性)，查MPN定量大腸菌群、糞大腸菌群值。實驗表明，乳糖膽鹽管變黃色及導管產氣、乳糖微量管黃色產氣、EMB出現紫黑色菌，EC肉湯混濁，樣品幾項實驗均為陽性結果，同時用大腸菌株(CMCC 44113)做平行對照，結果一致，說明方法可行。腸桿菌科細菌E75/15生化系統鑒定實驗采用國產微生物試劑公司成熟產品，疾控和食品檢驗單位均有應用，多次測試表明，實驗結果穩定，準確率高，對照菌株埃希氏大腸菌結果明顯，判定準確。紫菜卷樣品中篩選到的紫黑色、革蘭氏染色陰性的桿菌，經氧化酶測試后，全套生化試劑鑒定細菌編碼為04222，初步判斷為普城沙雷氏菌，該菌為條件致病菌，兼性厭氧，一般存在于土壤，實驗中未檢測到致病性的大腸桿菌，但條件致病菌的存在仍然提示食品可能受到糞便和土壤污染，應加強檢測及管理。

　　從實驗觀察，校園食品中，加工程序較多、配料較復雜、存放較長時間的食品易發生食品安全問題，此類食品有：奶茶、豆漿、綠豆沙等飲品、面包、奶油蛋糕等糕點;香腸、烤雞等肉制品微生物指標超標都很容易發生食物中毒。本次實驗，我們選取了紫菜卷作為實驗標本，設計了幾項重要指標進行方法學研究，旨在提高食品衛生實驗室檢測和報告能力。菌落總數測定是用來判定食品被細菌污染的程度及衛生質量，它反映食品在生產過程中是否符合衛生要求，菌落總數的多少在一定程度上標志著食品衛生質量的優劣。而大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染，大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。而糞大腸菌則是總大腸菌群的一個亞種，直接來自糞便，若檢出糞大腸菌群即表明受檢物已被糞便污染，它能更貼切地反應食品受人和動物糞便污染的程度。

　　食品安全微生物學檢測常常選用3M和大腸菌群紙片來快速測試，該方法適合于篩檢，結果還不夠直觀精確。本實驗建立了一套平板菌落計數法測定菌落總數，多管發酵法測定大腸菌群和糞大腸菌群和腸桿菌科E75/15鑒定系統,相結合的方法，直接分離和觀察細菌形態、菌落特征、生化反應現象，能鑒定到大腸菌群的菌種，提高了致病菌的檢驗能力，實驗結果則更直觀可信，該實驗技術本身不需要特殊儀器設備，可行性高，覆蓋范圍廣，鑒定結果準確可靠，符合國家衛生標準檢驗要求。

　　譚楚婷 李婷婷 謝雄雄 羅軍* 

　　南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院

　　*羅軍，女，副高，碩士，研究方向：食品衛生檢驗?；痦椖浚和话l食品安全事件的微生物學檢驗、評估及應急處理實踐教學體系的研究，南方醫科大學2014年特色教育教學改革立項建設項目(2013-84-22)