□ 沃特世公司 供稿

　　氯霉素是一種價格廉宜的廣譜抗生素。氯霉素在某些易感個體中涉及毒性作用。作為致癌物質和基因毒性化合物的可疑對象，氯霉素相關的再生障礙性貧血(骨髓抑制)致命病例已有廣泛記載。因此，在歐盟、加拿大、美國以及一些亞洲和南美國家均禁止將其用于食用性動物、昆蟲和水產養殖。歐盟委員會指令2003/181/EC規定，任何用于檢測食品中氯霉素的方法的最小性能限值(MRPL)為0.3µg/kg。

　　由于產品保質期較短，需要快速的處理時間，因此乳制品檢測實驗室以往都采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對大量樣品進行篩查。雖然ELISA可以對氯霉素進行靈敏而快速的篩查，但它的一個缺點是假陽性結果很多，據報某些案例中的假陽性水平達到16%。

　　免疫吸附劑與干擾基質之間的交叉反應經常會導致牛奶中氯霉素的誤檢，從而造成不必要的產品銷毀。質譜檢測可以提高選擇性，有助于區分氯霉素和污染基質。此外，質譜檢測結合液相色譜(LC)可以避免采用氣相色譜法篩查氯霉素時所需的費時衍生化處理步驟。為了讓實驗室能夠充分利用這些優勢，近期的技術進展著重于提高儀器可用性和穩定性。ACQUITY QDa檢測器易于使用，不需要專業的質譜知識，因而可以方便地整合到LC工作流程中。

　　沃特世解決方案

　　Oasis®HLB;

　　ACQUITY UPLC®HSS C18色譜柱;

　　ACQUITY UPLC I-Class系統;

　　ACQUITY QDaTM檢測器。

　　應用優勢

　　提供了一種牛奶中氯霉素的快速篩查方法。對檢測結果低于規定限值的樣品進行定量篩查。

　　對管制抗生素進行簡單而靈敏的檢測。

　　將質譜檢測簡便應用于現有LC工作流程。

　　實驗

　　UPLC條件

　　LC：ACQUITY UPLC I-Class;

　　運行時間：5min;

　　色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18，1.8µm，2.1×100mm;

　　流動相：10mM醋酸銨的45∶5甲醇/水溶液;

　　進樣體積：10µL。

　　檢測條件

　　檢測器：ACQUITY QDa;

　　電離模式：ESI;

　　SIR通道：m/z 321.0;

　　錐孔電壓：15V;

　　探頭溫度：缺省(600℃);

　　毛細管電壓：缺省(0.8kV);

　　采樣速率：缺省(5Hz)。

　　樣品制備

　　稱取半脫脂牛奶(5g)樣品，裝入25mL離心管中，強化至濃度達到0.3µg/kg。通過向樣品中添加己烷(5mL)和70%乙腈溶液(15mL)，完成脂肪去除和蛋白質沉淀。振搖樣品，然后在3900G(4℃)下離心10min。去除下面的乙腈層(5mL)，然后用10%甲醇稀釋至總體積為15mL。

　　使用甲醇(2mL)和水(4mL)對Oasis HLB 3cc(60mg)小柱進行平衡。將稀釋后的樣品(15mL)加載到小柱上，然后用5%甲醇溶液(6mL)清洗小柱。使用100%甲醇(6mL)洗脫氯霉素。隨后將洗脫液在氮氣中蒸發，用10%甲醇溶液(300µL)復溶后轉入LC-MS分析。

　　標準品制備

　　采用上述樣品制備方法制備空白牛奶樣品(未強化)。將空白基質樣品在氮氣中干燥后，使用不同濃度的標準溶液復溶，以建立范圍相當于0.075～1µg/kg的6點校準曲線。

　　結果與討論

　　在分析牛奶提取物之前，調試氯霉素的最佳源條件，確定ACQUITY QDa檢測器的預優化源參數可以提供最有效和最靈敏的檢測結果。氯霉素在15V錐孔電壓的負離子模式下靈敏度最高。使用上述方法，通過基質匹配校準曲線可以對歐盟MRPL的強化牛奶樣品進行準確定量。在0.075～1µg/kg的選定工作范圍內，氯霉素具有出色的線性(R2>0.995)，如圖1所示。

　　為了評估基質效應，將基質匹配校準曲線與相同范圍的溶劑校準曲線進行比較。圖2顯示了基質匹配和溶劑校準曲線的疊加圖。從該疊加圖中可以明顯看出基質效應(離子增強)。通過統計方法也可以證實存在基質效應，利用各校準曲線的斜率(樣品斜率/標準品斜率X100)，計算出基質效應為177%。盡管存在基質效應，使用基質匹配校準曲線仍然可以對牛奶中的氯霉素實現準確的定量篩查。

　　對空白牛奶平行樣品進行分析，未檢出假陽性。圖3A顯示了一個空白提取樣的色譜圖示例，圖中只觀察到基線噪音。對于歐盟MRPL強化4個平行牛奶樣品，樣品提取后進行重復分析(不使用價格昂貴的氘代內標)(n=8)。對照基質匹配校準曲線對最終樣品進行定量。圖3B顯示了強化濃度(0.3µg/kg)下平行樣的氯霉素峰，峰間信噪比(S/N)≥50，達到良好水平。

　　結論

　　本文開發了一種用于定量篩查牛奶中氯霉素的準確、穩定的方法。這種方法經證實可在無內標的情況下輕松達到法規要求的檢測水平，同時在歐盟MRPL(0.3µg/kg)水平下表現出優異的重復性。質譜額外的檢測區分能力提高了結果的特異性，未檢出假陽性。